葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——未授粉子房离体培养技术

黄金华，董彦琪，王文英，刘喜存，马晓红

（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）

未授粉子房/胚珠离体培养技术属于离体雌核发育途径（in vitro gynogenesis）[1-5]，是将未授粉子房/胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下诱导雌核发育，使其生长发育形成单倍体胚和植株的过程。利用该技术可快速获得纯系，缩短育种周期，加速育种进程。笔者侧重综述了该技术的一些重要影响因素，如基因型、胚囊发育时期、接种方式、植株生长环境、植物生长调节剂、碳源、硝酸银、低温预处理、热激处理、倍性鉴定以及植株再生等，为该技术的开展和应用提供可行的理论依据。

1 基因型

基因型是影响未授粉子房胚胎发生的重要因素之一，选择合适的基因型是植物未授粉子房离体培养成功的关键。Shalaby[2]对12种不同基因型西葫芦品种的未授粉子房培养发现，‘Raad’F1材料表现最佳，胚诱导率为48.4%，每皿成苗15株。谢冰等[6-7]和刘栓桃等[8]研究也表明西葫芦雌核离体培养存在明显的基因型差异。刘栓桃等[8]对9个不同基因型西葫芦材料的未授粉胚珠诱导培养发现，再生植株率最高的能达到33.33%，最低的仅为2.67%。杜胜利等[9]研究发现‘津春3号’的胚芽和愈伤组织诱导率均高于‘津杂2号’；陈小鹏等[10]也认为黄瓜基因型对雌核发育有着重要的影响。裴晓利等[11]研究表明，不同基因型黄瓜的未授粉子房对离体诱导培养的敏感度不同，9个品种单倍体诱导率变化幅度为65.52%～93.33%。Ficcadenti等[5]对2个甜瓜品种（‘Reticulatus’‘Inodorus’）及其杂交种进行了未授粉子房培养，结果显示，‘Reticulatus’出胚率最高。韩丽华等[12]研究发现甜瓜不同的正反交组合对单倍体的诱导有显著影响。

2 胚囊发育时期

胚囊发育时期对胚状体的诱导至关重要。谢冰等[6-7]研究表明开花前1 d和开花当日西葫芦胚珠诱导频最高；刘栓桃等[8]对9个西葫芦材料进行不同开花时期取材试验，结果表明除1个材料没能得到再生植株外，其他均表现为开花当天的胚珠最适合诱导培养，再生植株率最高；陈学军等[13]研究表明处于成熟胚囊期即开花当天的西葫芦未授粉子房的胚状体诱导率、成苗率均最高。Gémesné等[14]发现黄瓜雌花开放前6 h胚囊刚好形成，胚诱导率最高。刁卫平等[15]发现，开花前1～4 d的黄瓜子房均可诱导获得胚芽，但以开花前2～3 d的子房诱导率最高。Shalaby[2]对南瓜‘Giad’‘Raad’F1代的第一节雌花、第二节雌花和第三节雌花分别进行未授粉胚珠离体培养，发现第二节雌花胚诱导和成苗效果最佳。孙守如等[16]发现开花前1 d的南瓜胚珠已成熟或接近成熟，易于诱导。

3 接种方式

接种方式直接影响雌核发育的营养吸收，从而影响雌核发育的途径。陈学军等[13]比较4种接种方法对愈伤组织的影响，结果表明横切分法接种的胚珠最先从切口处长出愈伤组织，且愈伤组织诱导率最高可达28%；其次为啄切、纵切而以完整胚珠法所得愈伤组织诱导率最低，为6%。究其原因可能是横切、啄切和纵切给外植体以较大的创伤面而激发了愈伤组织的形成，也可能是创伤面增强了未授粉胚珠对养分的吸收能力。

4 生长环境

季节对未授粉子房离体培养的影响是显著的，这可能与植物的生理生长特性有关。Przyborowski等[17]在黄瓜单倍体诱导中发现，春季材料的诱导率很低，仅是夏季材料诱导率的1/4。魏爱民等[18]研究表明黄瓜离体雌核发育的单倍体胚胎发生率和植株再生率在温度相对较高的6月下旬、7月上旬以及9月份明显高于其他季节；生长发育前期的供体植株单倍体再生率相对较高且稳定；随着供体植株逐渐衰老，其未授粉子房培养的污染率不断上升；种植于塑料大棚内的供体材料比种植在露地中的供体材料具有更高的单倍体胚胎发生率和成苗率。盛慧[19]试验结果表明，秋季生长的黄瓜材料诱导率要高于春季，且不易污染，冬季的诱导效果一般。

此外，谢冰等[7]证实不同播期的西葫芦材料胚状体发生率存在极显著差异，秋播材料的诱导率最高，夏播与春播都很低；孙守如等[16]在南瓜上也发现胚状体发生和小苗的诱导集中在7月中旬和8月中旬。

5 培养基

5.1 基本培养基

黄瓜未授粉子房的离体培养一般采用MS培养基或是在MS培养基的基础上对某些成分作一些调整[14]，也有使用专门针对黄瓜离体雌核诱导的CBM作为基本培养基的[9]。谢冰[6-7]和陈学军等[13]在西葫芦未授粉胚珠离体培养中分别采用的是N6培养基和MS培养基。谢冰等[7]研究认为培养基对西葫芦胚状体诱导率影响较大，筛选的M3、M2培养基有较高的利用价值。厚皮甜瓜的离体雌核诱导也是在MS培养基上诱导胚状体发育成苗的[12]。

5.2 激素

激素对胚发生有着重要作用。Metwally等[4]在诱导西葫芦未授粉胚胎分化时分别使用质量浓度为 0.1、1.0、5.0、10.0 mg·L-1的 2，4-D，结果发现 1.0和5.0mg·L-12，4-D处理的胚诱导率较高。谢冰等[7]筛选出2组适合西葫芦胚状体诱导的培养基，分别是N6+2.00 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA 和 N6+4.00 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-16-BA。陈学军等[13]在西葫芦未授粉胚珠培养过程中用 MS+1.00 mg·L-12，4-D+0.50 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA诱导出愈伤组织。

陈小鹏等[10]在黄瓜未授粉子房的胚状体诱导试验中发现，TDZ明显促进胚状体的生长和膨大，质量浓度为0.06和0.08 mg·L-1时胚状体诱导率（分别为66.7%和64.9%）都极显著高于其他处理，并且两者之间没有显著差异。Diao等[20]认为，TDZ能促进黄瓜胚胎形成，以0.04 mg·L-1效果最佳。Malik等[21]研究发现，诱导培养基中添加0.04和0.02 mg·L-1的TDZ能有效促进甜瓜未授粉子房胚珠愈伤产生，胚诱导率分别为46.60%和65.83%，而质量浓度为0.60 mg·L-1的6-BA激素可显著提高外植体再生率。

此外，Kwack等[22]研究认为，植物激素对南瓜的胚发生有着重要作用。韩丽华等[12]用细胞分裂素Zip、BA和IBA成功地诱导出厚皮甜瓜的胚状体植株。

5.3 碳源

一般采用蔗糖作为碳源。谢冰等[6]关于西葫芦离体雌核培养诱导胚状体的试验表明，30 g·L-1蔗糖对胚状体的发生是有利的，诱导率较高。陈小鹏等[10]试验表明蔗糖质量浓度为40 g·L-1时黄瓜胚状体诱导效果最好。Shalaby[2]在西葫芦品种‘Eskan⁃drani’胚珠诱导时使用 30、60、90 g·L-1的蔗糖质量浓度梯度比较发现，30 g·L-1时胚珠诱导效率最佳，而90 g·L-1时胚珠完全不能生长。这些结果表明，在愈伤组织芽分化时可能需要较低的渗透压。韩丽华等[12]研究表明甜瓜胚状体诱导适宜蔗糖质量浓度为 30 g·L-1。

5.4 AgNO3

AgNO3是乙烯合成的抑制剂。Mohiuddin等[23]认为AgNO3影响愈伤组织的内源激素代谢从而有利于瓜类作物植株的再生。韩丽华等[12]研究表明AgNO3有利于甜瓜胚状体的诱导，当质量浓度为 80 mg·L-1时出胚率最高，为0.74%。这可能是由于NO3-影响了离体培养过程中的某种激素的代谢，从而间接影响了胚状体的形成与生长。而Diao等[20]研究发现AgNO3对胚诱导并没有显著影响，但会缩短胚胎萌芽期和提高胚胎形成数目，且选用的材料之间出胚率并无显著差异。

6 处理方式

6.1 低温预处理

低温预处理极有可能改变雌核发育途径，从而导致单倍体胚形成。Kwack等[22]研究表明，南瓜在5℃条件下预处理2d能提高胚胎的发生率。Shalaby[2]研究表明西葫芦品种‘Queen’F1在4℃预处理4 d时效果最佳。Metwally等[4]将开花前1 d的西葫芦品种‘Eskandarani’在4℃条件下分别进行0、2、4、8d 预处理，结果发现不进行预处理的的材料具有最高的胚诱导率。

6.2 热激处理

Gémesné等[14]对黄瓜离体雌核进行热激处理，结果表明，在诱导培养时35℃热激处理2～4 d获得的胚状体诱导率和植株再生诱导率最高。Diao等[20]进一步对黄瓜热激处理，在35℃条件下热激3 d的效果较2 d和4 d的好。陈小鹏等[10]认为35℃热激处理是黄瓜未授粉子房胚状体诱导的最佳预处理温度。Shalaby[2]研究表明西葫芦品种‘Queen’F1在32℃热激处理4 d时效果最佳。

7 倍性鉴定与植株再生

7.1 倍性鉴定

瓜类二倍体植株与单倍体、三倍体、四倍体在形态上有比较明显的差别[24]，主要表现在子叶、真叶、花的形状和颜色，果实形状以及种子的形态。这些形态差异是从外观上用目测法鉴别瓜类多倍体较为可靠的指标。谢冰等[6]用西葫芦未授粉胚珠诱导出120株再生植株，其中42株性状表现符合二倍体植株（2n=2x=40）特征且育性正常，并获得自交果实及种子。

对获得的植株细胞染色体计数是最有效的方法，但染色体制片需要较高的细胞学水平，且费时、费力。Metwally等[4]对由西葫芦未授粉子房离体诱导的20株再生植株的根尖染色体进行观察，结果表明，有5株单倍体植株（2n=x=20）、15株二倍体植株（2n=2x=40）。Diao等[20]对40株再生黄瓜植株的卷须染色体染色进行观察，结果表明，有2株单倍体植株（2n=x=7）、33株二倍体植株（2n=x=14）、5株四倍体植株（2n=4x=28）。

叶绿体数目随染色体倍数的升高而增加，因而可采用气孔保卫细胞叶绿体计数法来间接鉴别再生植株的倍性。刘栓桃等[8]将西葫芦未授粉胚珠诱导的20株再生植株经气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定，结果为8株单倍体植株，12株二倍体植株。

7.2 植株再生

谢冰等[6]在西葫芦未授粉胚珠离体培养中，以20 g·L-1蔗糖或葡萄糖作碳源的无激素N6植株再生培养基上培养出健全胚状体的成苗。刘栓桃等[8]对4个西葫芦品种未授粉子房培养，在质量浓度为0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D 的培养基上再生植株产率最高，达28.33%。陈学军等[13]在西葫芦未授粉胚珠离体培养中，诱导的愈伤组织在MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA+2.0%蔗糖+0.8%琼脂培养基上芽诱导率最高，为15.6%；高浓度的NO3-有利于不定芽根的形成，但其作用机制尚不清楚。孙守如等[16]研究发现观赏南瓜未授粉胚珠诱导胚状体的效果以 MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+30.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂处理较好，分化、再生培养基分别以MS+30.0g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂、MS+30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂+1.0 g·L-1活性炭效果最佳，其胚状体发育成正常植株率达70%以上。

8 问题与展望

利用未授粉子房培养技术获得瓜类单倍体植株是一个较为成功的途径，众多国内外学者研究了一些影响因素，如基因型、胚囊发育时期、接种方式、植株生长环境、植物生长调节剂、碳源、硝酸银、低温预处理、热激处理、倍性鉴定以及植株再生等，并取得了一些重要进展，如2，4-D与NAA、6-BA配合使用虽然对胚状体的诱导率有利，但畸形胚状体的比例较高，主要在诱导过程中出现畸形胚状体或健全胚状体转接后表现出发育异常；诱导温度高于35℃时接种组织的褐化和玻璃化情况较严重，生长培养基中加入0.05 mg·L-1抗坏血酸针剂可有效防止胚状体再生长过程中的氧化；未授粉胚珠的取样部位对胚状体的形态建成及后续的成苗有显著影响，子房中部的胚珠发育充分有利于诱导出健全胚状体；叶片保卫细胞叶绿体计数鉴定法与再生植株自交后代田间性状整齐度观察相结合，不仅可鉴定再生植株的起源和倍性，而且还可对再生植株的农艺性状进行调查研究。

未授粉子房培养技术已在黄瓜、西葫芦、甜瓜、南瓜等瓜类作物取得了单倍体胚和单倍体植株，该技术为研究离体雌核发育机制、开展更广泛的未授粉胚珠（双）单倍体培养方法奠定了基础。离体培养能够引起各种类型的突变，影响培养物的遗传稳定性，这已是不争的结论。瓜类离体雌核发育胚状体的形成及成苗过程涉及的影响因素更为复杂，如需全面地了解再生植株成苗的机制，尚需进行更加深入的研究。