乌蕨、鸡屎藤提取物的抑菌活性研究

廖建良，单沛贤

（惠州学院生命科学系/生物技术研究所，广东 惠州 516007）

乌蕨、鸡屎藤提取物的抑菌活性研究

廖建良，单沛贤

（惠州学院生命科学系/生物技术研究所，广东 惠州 516007）

本文采用滤纸片扩散法，稀释倒平板法，研究乌蕨及鸡屎藤提取液的抑菌作用。选用菌种为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、青霉菌和黑曲霉。目的在于研究乌蕨及鸡屎藤利用到食品防腐领域的可能性。结果表明：乌蕨的乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌具有一定的抑菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌的效果更佳，对两种真菌没有抑菌作用。其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌最低抑菌浓度在0.25g/ml。乌蕨的水提取物对细菌抑菌效果明显，对两种真菌没有抑菌作用。乌蕨的抑菌效果具有热稳定性，但pH值对乌蕨的抑菌效果影响明显，在pH值7至9之间，乌蕨的抑菌效果减弱或完全丧失。而鸡屎藤的乙醇提取物和水提取物对供试菌种均无抑菌作用。同时乌蕨与鸡屎藤在水提取的情况下抑菌活性没有联合提高的效果。

乌蕨提取液；鸡屎藤提取液；抑菌活性

由微生物引起的食品霉变、腐败对人类的生产和生活带来很大的影响，造成了巨大损失。为了更好地保全食品原有的风味和更大限度地提高食品的货价期，食品防腐剂成了首选。但近年来，食品防腐剂对人体安全健康的影响受到了社会的密切关注。而天然防腐剂的开发也成了社会研究的课题。[1-4]天然的生物防腐剂一般来源于植物，因其天然、高效、无毒或低毒以及不破坏食品的原有风味等显著特性，成为国际食品添加剂市场的新宠[2]。我国是世界上植物资源最丰富的国家之一，药用植物种类繁多，应用历史悠久[5]，在植物源天然防腐剂研究领域有得天独厚的优势。乌蕨[Stenoloma chusanum（L.）Ching]鳞始蕨科（又称陵始蕨科）（Lindsaeaceae）乌蕨属植物，又名大叶金花草、小叶野鸡尾、蜢蚱参、细叶凤凰尾等，是一种民间中草药。根状茎短而横走，密生赤褐色钻状鳞片。叶羽状细裂，厚革质，无毛；孢子囊群位于裂片顶部，顶生于小脉上，每裂片1-2枚；囊群盖厚纸质，杯形或浅杯形，口部全缘或多少啮断状[6]。乌蕨在民间有“万能解毒药”之称，广泛用于解食物和农药中毒，还用于治疮毒、毒蛇咬伤等[7]。现代药理实验研究表明，乌蕨具有保肝、抗炎、止血、抗菌作用，临床上用于治疗慢性肾衰、下肢顽固性溃疡具良好效果[7]。其主要有效成分是黄酮类化合物[8]。鸡屎藤[Paederia scandens（Lour.）Merr.]茜草科（Rubiaceae）多年生草质藤本植物。藤本，通常长3-5米，多分枝。叶对生，纸质。聚伞花序排成顶生带叶的大圆锥花序或腋生而疏散少花[9]。性平，味甘、微苦。能祛风利湿，消食化积，止咳，止痛；用于风湿筋骨痛、铁打损伤、外伤性疼痛、肠胃绞痛、黄疸型肝炎等；本品有镇痛、降压与抑菌作用[10]。有关乌蕨和鸡屎藤提取物的抑菌活性研究鲜见报道。本实验对乌蕨及鸡屎藤等药用植物进行深入研究，对植物抑菌活性物质进行筛选，提取高效安全的活性物质。用滤纸扩散法研究其不同提取液对对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、青霉菌和黑曲霉的抑菌作用和抑菌效果稳定性分析试验，目的在于研究出具有保健与防腐功能、高效、安全、无或低副作用的天然防腐剂，应用于食品保鲜与药物保鲜。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

1.1.1 药材

新鲜乌蕨、新鲜鸡屎藤地上部分采于惠州学院后山。以上材料均于采摘后洗净，自然风干24h后，磨碎，备用。

1.1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、青霉菌和黑曲霉均由惠州学院微生物实验室提供

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 主要仪器

LDZX-40KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；HD-650-U超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；PSH-525生化培养箱（重庆试验设备厂）；MJ-250BPOZA Midea多功能食物搅拌器（广东美的生活电器制造有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器水浴槽（上海青浦泸西仪器）；PC-1000数显式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；PHS-3C精密级数字式酸度计（上海弘毅仪器仪表有限公司）

1.2.2 应用试剂

95％乙醇（台山市粤侨试剂塑料有限公司）；氯化钙（天津市永大化学试剂开发中心）；氯化钠（台山市粤侨试剂塑料有限公司）；葡萄糖（台山市粤侨试剂塑料有限公司）。

1.3 培养基

营养琼脂培养基：称取蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉15g，牛肉膏粉3g，加水定容至1000ml，加热至沸腾，分装至锥形瓶，于0.1MPa，121℃灭菌20min。用于细菌的培养。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：称取去皮马铃薯200g，加入蒸馏水800ml，加热煮沸30min，用四层纱布过滤，取滤液，加入葡萄糖20g，琼脂粉16g，加蒸馏水定容至1000ml，加热至沸腾，分装至锥形瓶，于0.1MPa，121℃灭菌20min。用于青霉菌和黑曲霉菌的培养。

1.4 方法

1.4.1 乌蕨与鸡屎藤乙醇提取液的制备

称取自然风干磨碎的新鲜乌蕨地上部分100g，加入适量的95％乙醇，在40℃的水浴槽中旋转水浴12h，抽滤，取滤液，再加入适量的95％乙醇，在40℃的水浴槽中旋转水浴12h，抽滤，取两次滤液，用RE-52AA旋转蒸发器水浴槽于40℃减压浓缩至30min内无乙醇蒸出为止，得浓缩液，定容至100ml.即为质量浓度为1g/ml的醇提物供试品。制备好的提取液保存于4℃的冰箱中。

鸡屎藤乙醇提取液制备方法同上。

1.4.2 乌蕨与鸡屎藤水提取液的制备

称取自然风干磨碎的新鲜乌蕨地上部分100g，加入适量的蒸馏水，在80℃的水浴槽中旋转水浴12h，抽滤，取滤液，再加入适量的蒸馏水，在80℃的水浴槽中旋转水浴12h，抽滤，取两次滤液，用旋转蒸发器水浴槽于80℃减压浓缩至30min无水蒸出为止，得浓缩液，定容至100ml.即为质量浓度为1g/ml的水提物供试品。制备好的提取液保存于4℃的冰箱中。

鸡屎藤水提取液制备同上。

取25ml制备好的乌蕨水提取液及25ml制备好的鸡屎藤水提取液充分混合，得到乌蕨鸡屎藤混合水提取液。

1.4.3 供试菌株的活化

从微生物实验室中取出菌种，接种到无菌斜面培养基中，细菌于恒温培养箱中用37℃培养24h，霉菌于恒温培养箱中用28℃培养48h后密封保存于4℃的冰箱中备用。

1.4.4 菌悬液的制备

冰箱中取出以活化的菌种，于无菌操作台中用烧红冷却的接种环挑取少许已活化的菌种，置于装有9ml无菌生理盐水的试管中，充分混合，密封备用。

1.4.5 圆滤纸片的制备

用标准6.00mm打孔器打出滤纸片，置于干净的试管中密封，于0.1MPa，121℃灭菌20min，备用。

1.4.6 提取液抑菌效果的测定

采用滤纸扩散法[4]。用灭菌后的镊子取出无菌滤纸片，于足量的提取液（质量浓度1 g/mL）中浸泡15min，备用。选用直径为9ml培养皿，经过0.1MPa，121℃灭菌20min处理后，每皿加入10ml的培养基，待冷却凝固后，用微量可调节移液枪于每培养皿中加入50ul的菌悬液，用灭菌的棉签均匀涂开菌种。待平板干燥后，用灭菌后的镊子夹出充分浸泡过提取液的滤纸片，轻轻贴于平板表面。每个平板放置3三片，每个菌种重复3个平板。以无菌蒸馏水作为对照组，细菌于恒温培养箱中用37℃培养24h，霉菌于恒温培养箱中用28℃培养48h。取出后用游标卡尺测量抑菌圈的大小，比较其抑菌效果。抑菌圈直径大于8 mm为有明显抑菌作用，小于6 mm为没有抑菌作用，抑菌圈在6～8 mm之间为有一定的抑菌作用。

1.4.7 提取液最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用稀释法[4]。分别用无菌蒸馏水将各个提取液稀释（V/V）成1、0.5、0.25、0.125g/ml等系列浓度。用微量可调节移液枪吸取各个浓度的提取液1ml，分别加入到无菌培养皿中，再倾入10ml培养基，充分摇匀。待冷却凝固后，用微量可调节移液枪于每培养皿中加入50ul的菌悬液，用灭菌的棉签均匀涂开菌种。待平板冷却凝固后，用微量可调节移液枪于每培养皿中加入50ul的菌悬液，用灭菌的棉签均匀涂开菌种。一个浓度梯度每个菌种重复3个平板，以无菌蒸馏水作为对照，细菌于恒温培养箱中用37℃培养24h，霉菌于恒温培养箱中用28℃培养48h。取出观察各菌种生长情况，以没有菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。提取液的最低抑菌浓度越低，表明其抑菌效果越明显。

1.4.8 提取液热稳定性测定

采用滤纸扩散法[4]。用灭菌后的镊子取出无菌滤纸片，加入到足量的提取液（质量浓度1 g/mL）中，分别置于40℃、60℃、80℃中水浴处理30min，选用直径为9ml培养皿，于0.1MPa，121℃灭菌20min处理后，于每皿加入10ml的培养基，待冷却凝固后，用微量可调节移液枪于每培养皿中加入50ul的菌悬液，用灭菌的棉签均匀涂开菌种。待平板干燥后，用灭菌后的镊子夹出充分浸泡过提取液的滤纸片，轻轻贴于平板表面。每个平板放置3三片，一种温度处理每个菌种重复3个平板。细菌于恒温培养箱中用37℃培养24h，霉菌于恒温培养箱中用28℃培养48h。取出后用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小，比较温度对其抑菌效果的影响。

1.4.9 pH对抑菌效果的影响

酸碱调节溶液调节提取液的pH值，考虑原溶液的pH，将原溶液的pH值调节成pH=7，pH=9时，用1.4.6的方法进行抑菌效果的测定，每种提取液的不同pH值按每菌种3个重复进行试验，对比pH值对其抑菌效果的影响。

2 结果与分析

2.1 滤纸片法测定抑菌效果

由表1可知，乌蕨的乙醇提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌圈平均直径分别为7.15、9.23、7.52mm；乌蕨水提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌圈平均直径分别为13.83、11.54、6.33mm；乌蕨鸡屎藤混合水提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌圈平均直径分别为8.09、8.12、8.09mm。同时以上3种提取液对黑曲霉菌和青霉菌均无出现抑菌圈。而鸡屎藤的两种提取液以及对照组对5种试验菌种都没有出现抑菌圈。综上所述可知乌蕨对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑菌作用，对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌作用。鸡屎藤的两种提取物对五种试验菌种均没有抑菌作用。乌蕨鸡屎藤混合水提取液抑菌圈均比乌蕨水提取液的抑菌圈小，乌蕨鸡屎藤混合水提取液对三种细菌的抑菌效果比乌蕨的水提取液抑菌效果还差，说明乌蕨和鸡屎藤的抑菌作用没有联合提高叠加的效果。

表1 乌蕨和鸡屎藤提取液抑菌效果（24h）

2.2 乌蕨乙醇提取物最低抑菌浓度（MIC）测定

2.2.1 乌蕨乙醇提取物最低抑菌浓度（MIC）测定

由表2可知乌蕨乙醇提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，其最低抑菌浓度为0.25g/ ml，对枯草杆菌的抑菌作用相对较弱，对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌作用。

表2 乌蕨乙醇提取液最低抑菌浓度（MIC）

2.2.2 乌蕨水提取物最低抑菌浓度（MIC）测定

由表3可知乌蕨水提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌具有一定的抑菌效果，最低抑菌浓度为1g/ml。对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌作用。

表3 乌蕨水提取液最低抑菌浓度（MIC）

2.3 乌蕨提取物热稳定性测定

2.3.1 乌蕨乙醇提取物热稳定性测定

由表4可知在室温20℃至80℃，乌蕨乙醇提取物对3种细菌（绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌）的抑菌效果在20℃至60℃差异不明显，在80℃时，抑菌活性有相对明显的提高，且其抑菌效果在80℃以内具有热稳定性。在不同温度条件，乌蕨乙醇提取物对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌效果。

表4 热处理对乌蕨乙醇提取液抑菌效果的影响

2.3.2 乌蕨水提取物热稳定性测定

由表5可知在室温20℃至80℃，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果虽有变化，但其抑菌直径仍然大于8mm，对枯草杆菌的抑菌效果受温度的影响不大，说明乌蕨水提取物对细菌的抑菌作用在20℃至80℃范围内具有热稳定性。在不同温度条件，乌蕨乙醇提取物对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌效果。

表5 热处理对乌蕨水提取液抑菌效果的影响

2.4 不同PH值环境对乌蕨提取物抑菌效果的影响

2.4.1 pH对乌蕨乙醇提取液的抑菌效果影响

由表6可知，pH环境对乌蕨乙醇提取物具有较大的影响，在pH值5.11至9的范围内，乌蕨乙醇提取物对3种细菌（绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌）的抑菌效果随pH值的升高而减弱，pH=9时对金黄色葡萄球菌的无抑菌作用，具体原因有待研究。在不同pH值环境中，乌蕨乙醇提取物对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌效果。

表6 pH对乌蕨乙醇提取液的抑菌效果影响

2.4.2 pH对乌蕨水提取液的抑菌效果影响

由表7可见，pH值对乌蕨水提取物抑菌效果有一定影响。在PH4.57至9之间，乌蕨水提取物对枯草杆菌的抑菌随PH值增加而减弱。乌蕨水提取物在PH7至9之间，对金黄色葡萄球菌无抑菌作用效果；在PH为9时，对绿脓杆菌无抑菌效果。在不同PH值环境中，乌蕨水提取物对黑曲霉菌和青霉菌没有抑菌效果。

表7 乌蕨水提取液的pH对抑菌效果影响

3 结论与讨论

本实验结果表明乌蕨的水提取物和乙醇提取物对于绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑菌效果，尤其是对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果更为明显；其抑菌效果随着浓度的增加而增强，尤其是乌蕨的乙醇提取液对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为0.25g/ml，抑菌效果较好。乌蕨的水提取物和乙醇提取物对青霉菌，黑曲霉菌无抑菌效果。乌蕨的水提取物对绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为1g/ml，抑菌效果较好。乌蕨的水提取物和乙醇提取物的抑菌活性均有良好的热稳定性。本实验结果表明乌蕨的水提取物和乙醇提取物在偏酸性的环境下抑菌效果最佳，在中性至碱性环境中抑菌效果受抑制。这与报道基本吻合，乌蕨具有一定的保健效果[7-8]。鸡屎藤的水提取物和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、青霉菌和黑曲霉均无抑菌效果。同时乌蕨与鸡屎藤混合后其抑菌作用没有相加效应。

鸡屎藤是笔者家乡广东省紫金县人经常使用的民间药方，用于治疗喉咙发炎、感冒、消食消肿，在天气炎热时稀浓度作为解暑药，笔者及家人也经常使用，效果好。但，本实验没发现鸡屎藤的抑菌作用，这与《中草药学》[10]中记载的具有抗菌作用效果不一，与民间作为常用药效果不一[10]。鸡屎藤的水提取物对金黄色葡萄球菌没有明显的抑菌作用，与陈伟明[11]等人试验结果不一，与陈忠[12]、龙正海[13]、张梅[14]等人结果相似，具体原因有待进一步的研究。

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【责任编辑：吴跃新】

Study on Antimicrobial Activities of Extract from Leaves ofStenoloma Chusanum and Paederia Scandens

LIAO Jian-liang，SHAN Pei-xian
（Department of Life Science/Institute of Biotechnology，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

The antimicrobial activities of Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens extracts are studied in this paper by using filter paper diffusion process and dull dilution method.Cultures selected are Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，p.aeruginosa，Penicillium sp，and Aspergillus niger.The purpose is to study the possibility of Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens use to the field of food preservation.Results show that:the ethanol extract of Stenoloma chusanum Ching against Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，and Bacillus subtilis has a certain inhibitory effect，especial of Staphylococcus aureus，and no antimicrobial effects for two kinds of fungi.The minimum inhibitory concentration to Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis is 0.25g/ml.The water extract of Stenoloma chusanum Ching has antimicrobial effects for bacteria，and no antimicrobial effects for fungi.The inhibitory effect of Stenoloma chusanum Ching has thermal stability，but the antimicrobial activities PH tolerance range from 7 to 9，inhibitory effect of Stenoloma chusanum Ching weakens or completely loses.Paederia scandens ethanol extract and water extract have no inhibitory effect on the tested strains.And Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens in the case of water extracted antibacterial activity jointly improve the effect.

extract ofStenoloma chusanum；extract ofPaederia scandens；antimicrobial activities

Q949.95

A

1671-5934（2016）03-0009-05

2016-05-26

惠州学院生化与分子生物学重点学科项目[惠院科发（2009）41号]；广东省专业综合改革试点建设项目（粤教高函[2013]-113号）

廖建良（1965-），男，教授，硕士，广东紫金人，研究方向为植物学。