惠阳胡须鸡中A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性的研究

李红伟，陈圆，范红英

（惠州学院生命科学系，广东 惠州 516007）

惠阳胡须鸡中A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性的研究

李红伟，陈圆，范红英

（惠州学院生命科学系，广东 惠州 516007）

本研究旨在通过分析与脂肪性状相关的A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性，找出优势基因型个体即保持胡须鸡的肉质口感又能克服生长速度慢的特点，为下一步的基因型选择提供理论基础。本实验以惠阳胡须鸡作为实验材料，从鸡血液中提取DNA，通过PCR扩增、测序等分子生物学技术分析了A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性。结果表明：1）A-FABP基因发现了两处碱基突变，一个在第1685碱基处由C突变T，但由于不在编码区，没有氨基酸的改变，而另一个在第1830碱基处缺失了G，引起编码氨基酸的改变即缺失了D（天冬酰胺），进而导致蛋白质空间结构发生改变。2）H-FABP基因发现两个碱基突变，其中一个突变位点不在编码区，没有相应氨基酸改变，而另一个在第746碱基处由A突变为G，使得编码的氨基酸由赖氨酸变成谷氨酸，导致蛋白质空间二级结构发生改变。这些结果说明在惠阳胡须鸡中，A-FABP和H-FABP基因存在单核苷酸多态性，为下一步的基因型选择奠定了理论依据。

惠阳胡须鸡；A-FABP；H-FABP；单核苷酸多态性

惠阳胡须鸡为地方优良肉用型品种，又被称为三黄胡须鸡、惠州鸡、龙门鸡、龙岗鸡。体质结实，以肉嫩骨细，皮脆味鲜与三黄胡须的外貌驰名中外，在育种、生产和外贸活鸡市场上都具有较高的经济价值，但存在生长速度慢的特点。随着人们生活水平的提高，人们越来越追求高品质的食物，对于肉类的肉质品质要求也越来越高。而脂肪性状，特别是肌间脂肪含量与肉质口感密切相关。因此，寻找与脂肪性状相关的分子标记成为了家禽育种中的研究热点。

IMF（Intramuscular Fat，肌内脂肪）是判断肉类品质的一个重要指标[1]。IMF含量影响肉质口感，适当地提高IMF含量会使这些因素得到改善，从而提高肉的品质。心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因和脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因是影响IMF含量的候选基因[2，3，4]。

A-FABP即脂肪型脂肪酸结合蛋白，主要参与细胞内脂肪酸的摄取，并将其转运至β-氧化场所以及甘油三酯和磷脂合成部位，并且通过调节脂肪酸浓度来调控机体内脂类代谢的过程[5]。A-FABP定位于鸡的第2号染色体，主要包括4个外显子，分别编码24、5 8、34和16个氨基酸[6]。通过高低脂肪资源家系，发现A-FABP基因的表达水平差异能显著影响腹部脂肪沉积[7]。由于A-FABP能在肌内脂肪细胞中沉积甘油三酯，从而增加肌内脂肪，因此，它被作为影响肌内脂肪含量的候选基因而加以研究[8]。IMF含量和体重密切相关，而A-FABP基因表达量与鸡屠体重、全净膛率存在显著的正相关[9]。

H-FABP即心脏型脂肪酸结合蛋白，参与脂肪酸在细胞内的运输，将脂肪酸从细胞膜运送到脂肪酸氧化、甘油三酯和磷脂合成的位置[7]。它在细胞内与脂肪酸结合，使细胞内外保持一定的脂肪酸浓度差，促进细胞摄取脂肪酸[8]。鸡的H-FABP基因定位于23号染色体上，由4个外显子和3个内含子组成[9]。H-FABP是一种脂溶性蛋白，对甘油三酯的积累和氧化以及脂肪酸在细胞内的运输起重要作用，当心肌梗塞或萎缩的时候它常常作为一种生物标记被释放到血液循环中。正因为H-FABP能在心肌和脂肪细胞中沉积甘油三酯，从而增加IMF，因此，把它作为影响肌内脂肪含量的候选基因加以研究。

本研究旨在通过分析与脂肪性状相关的A-FABP和H-FABP基因单核苷酸多态性，找出优势基因型个体即保持胡须鸡的肉质口感又能克服生长速度慢的特点。研究结果显示惠阳胡须鸡中A-FABP和H-FABP基因存在单核苷酸多态性，为下一步的基因型选择奠定了理论依据。

1.材料与方法

1.1 实验材料

选用惠阳胡须鸡作为实验材料，样品采集于惠州金种家禽发展有限公司的保育场。将血样放入含肝素钠的采血管，放-20℃下保存。

1.2 总DNA的提取

利用DNA提取试剂盒（北京汇天东方科技有限公司）提取总DNA，步骤如下：

1.2.1 将保存在-20℃下的血样，放进4℃冰箱下冻融3-4个小时，待血样融后，取出30μL到离心管，补充缓冲液BB（来自DNA提取试剂盒）至200μL；

1.2.2 加入20μL蛋白酶K（来自DNA提取试剂盒），再加入200μL结合液CB（来自DNA提取试剂盒），放置在已经预热到70℃的水浴锅10分钟；

1.2.3 冷却后加入100μL的异丙醇，充分震荡、混匀；

1.2.4 将混合物加入吸附柱（来自DNA提取试剂盒），13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液；

1.2.5 加入500μL去除物IR（来自DNA提取试剂盒），12000rpm离心30秒，倒掉废液；

1.2.6 加入500μL漂洗液WB（来自DNA提取试剂盒），12000rmp离心30秒，倒掉废液；

1.2.7 将吸附柱放入空的收集管，13000rmp离心2分钟尽量除去漂洗液；

1.2.8 取出吸附柱放进干净的离心管，加入已经在65℃预热的洗脱缓冲液EB（来自DNA提取试剂盒），放置5分钟，12000rmp离心1分钟。

1.2.9 将所得的溶液重新加入离心吸附柱中，12000rmp离心1分钟。所得的溶液就是提取的DNA。

1.3 聚合酶链反应（PCR）

1.3.1 A-FABP的聚合酶链反应

PCR扩增体系为25μL，包括以下成分：

Green Mix12.5μL

无菌水11.5μL，

上游引物0.25μL，

下游引物0.25μL

模板DNA0.5μL

引物序列根据文献报道[5]，F 5’CCTTGTCTCATCCCATCT3’，R 5’AACTCTGCCCTCCTTATC 3’，引物由上海生物技术有限公司广东分部合成。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.2％凝胶琼脂糖电泳检测。

1.3.2 H-FABP的聚合酶链反应

PCR扩增体系为25μL，包括以下成分：

Green Mix12.5μL

无菌水11.5μL，

上游引物0.25μL，

下游引物0.25μL

模板DNA0.5μL

引物序列根据文献报道[12]，F1 5’TGAGTACATGAAGGCGTTGG 3’，R15′CGCGCTTTCCTATTCCTA3′；F25’AGGTGCAGCATCTGAGTG3’，R25’TTCACCGTCGCCTTGT 3’，由上海生物技术有限公司广东分部合成。PCR反应条件为94℃预变性8 min，（94℃45 s；53.2℃1 min，72℃1 min）35个循环后，72℃终延伸10 min，4℃保存。

1.4 电泳体系

用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增结果进行检测，电泳体系如下：

琼脂糖凝胶浓度1.2％（1.2g琼脂糖，100ml 1× TBE，2μl Goldview染料），电泳液1×TBE（108gTris，55g硼酸，0.5M EDTA（pH8.0）40ml加蒸馏水至1000ml后稀释10倍），6×Loading buffer 1μl与5μlPCR扩增产物混匀点样，电压100V，电泳40-60 min后，于WD-9413A凝胶成像分析仪下观察电泳条带。

1.5 DNA的纯化

利用DNA纯化试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）将PCR产物进行纯化，其步骤如下：

1.5.1 随机取20支PCR产物，分别将10支PCR产物混合加入一个大离心管，在大离心管中加入5倍体积的溶液A（来自DNA纯化试剂盒）充分混匀。

1.5.2 加入50μL的溶液B（来自DNA纯化试剂盒），震荡摇匀。将混合液体加入离心柱，静止2min。

1.5.3 12000 rmp离心30s。倒掉废弃液，

1.5.4 加入500μL溶液C（来自DNA纯化试剂盒），12000rmp离心30s。倒掉液体，

1.5.5 加入500μL溶液C（来自DNA纯化试剂盒），12000rmp离心30s，倒弃液体。

1.5.613000 rmp离心1min，洗去乙醇。

1.5.7 将离心柱室温敞开，静止10min，使得乙醇挥发干净。

1.5.8 加入已经预热的溶液D（来自DNA纯化试剂盒）静止2min。

1.5.912000 rmp离心2min，管底即纯化后的DNA。

1.6 测序

将纯化好的DNA送到广州华大基因公司，在ABI-3T30仪器进行测序。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

惠阳胡须鸡的A-FABP基因扩增结果，片段长度为268bp，结果见图1。

图1 A-FABP的PCR结果

惠阳胡须鸡H-FABP基因扩增结果，两对不同引物扩增片段分别为265bp、188bp，见图2、3。

图2 H-FABP引物1的PCR结果

图3 H-FABP引物2的PCR的结果

2.2 A-FABP和H-FABP基因测序结果分析

将测序结果与原始序列比对可知，A-FABP基因在第1685上发生C突变为T，但不在编码区上，不会导致蛋白质发生改变，但该基因第1830碱基处缺失了G（图4），导致其翻译后的蛋白缺少了天冬酰胺。而HFABP基因的在第746碱基处，由A突变为G（图5），导致翻译后，赖氨酸变成了谷氨酸。

图4 A-FABP上1830发生G的缺失

图5 H-FABP上746发生A突变为G

2.3 蛋白质结构的预测

2.3.1 A-FABP翻译的蛋白质：利用蛋白质预测结构网站http：//swissmodel.expasy.org/可以预测出AFABP无突变序列所翻译蛋白质的空间结构（如图6左）和突变后序列翻译的蛋白质（如图6右）。突变型其中一条多肽由无规则卷曲转变都为β-折叠，另一条多肽由β-折叠变为都在同一个平面。另外，在无突变的蛋白质存在β-转角，但在突变后的翻译的蛋白质没有了这个结构。

图6 A-FABP无突变（左）与突变型的蛋白质结构（右）

2.3.2 H-FABP翻译的蛋白质：利用蛋白质预测结构网站http：//swissmodel.expasy.org/可以预测出HFABP有原始序列所翻译蛋白质的空间结构（如图7左）和突变后序列翻译的蛋白质的可见结果（如图7右）。对比突变前后两幅图，可以看到在突变后一条多肽了一个β-转角，而在另外一条多了一个α-螺旋。由此可知，第746碱基A/G的改变使得蛋白质的空间结构发生了改变，可能影响H-FABP蛋白的功能。

图7 H-FABP无突变（左）与突变型的蛋白质（右）

3 讨论

肌内脂肪作为评价肉质的一共重要指标越来越受到重视，逐渐成为地方品种选育的关键性状。然而，肌内脂肪是一个综合性状，受遗传、营养、环境等诸多因素的影响[13，14，15]，常规选育方法的进度缓慢。所以利用分子辅助选择手段，加快早期选育已经越来越受到重视。在前人大量研究中，发现A-FABP和H-FABP可以作为脂肪沉积的候选基因。在陈继兰[16]的研究表明，对各品种IMF含量分析结果表明，鸡腿肌IMF含量高于胸肌，AA（艾拔益加肉鸡简称AA肉鸡）肉鸡和白莱航蛋鸡肌内脂肪含量显著低于优质地方品种-北京油鸡、矮脚鸡，实验结论与研究报道一致。在李文娟的研究中[17]H-FABP基因表达水平和IMF、屠体重存在显著的负相关，也就是说H-FABP基因表达量减少可引起北京油鸡、白莱航鸡和AA肉鸡的鸡肌内脂肪含量增加，这一结果与Gerbens[18]进行不同H-FABP基因型表达水平的研究结论相符。IMF含量和体重的影响密切相关，A-FABP基因表达对鸡屠体重、净膛率存在显著的正相关。

本实验是用惠阳胡须鸡作为实验材料，惠阳胡须鸡肉质鲜美，口感好，但是生长速度慢，影响其经济价值。所以本实验旨在找出A-FABP和H-FABP的优势基因，为早期选种提供理论依据。在A-FABP的研究上，我们选用常国斌[5]的引物，在常国斌的研究中，发现了A-FABP基因外显子3中1763位点变异，即在1763位点上G突变为A，引起了丝氨酸转变为天冬酰胺，与肌内脂肪性状密切相关，可作为肌内脂肪性状有效的候选标记进行研究。本次研究A-FABP中，从测序结果表明，在惠阳胡须鸡没用这个突变，即在1763上还是G，我们发现的突变是在在1830上发生碱基G的缺失，导致天冬氨酸的缺失，进而影响了蛋白质的空间结构。从已知的研究表明，A-FABP基因是保守的，保守的基因一般不会发生突变。所以，本次实验发现的突变所引起的蛋白质空间结构发生改变，这会不会导致蛋白质功能的改变，进而影响性状，这需要下一步实验研究证明。在H-FABP的研究上，我们选用王彦[12]的引物，在王彦的研究中，发现在引物1260位点上，IMF含量AA基因型最高，AB基因型最低；在引物2675位点上，IMF含量BB基因型最高，AB基因型最低。在我们的研究中这两个位点都没有发生改变，在韩光的实验[19]中推断出，H-FABP基因可能对鸡肉质性状具有很大的影响或与控制屠宰性能和肉质性状的主基因连锁，H-FABP基因中的B等位基因可能对于肉质性状具有较大的影响，特别是肉质风味，它能够作为分子标记应用在育种工作中[20]。而我们在746碱基A/G发生的突变，使得编码的氨基酸由赖氨酸变成谷氨酸，也是没有被发现过。所以本次实验结果会对惠阳胡须鸡的性状有什么影响，需要进一步研究加以证实。

参考文献：

[1]游小燕，杨飞云，谢跃伟.H-FABP基因在脂肪沉积中作用的研究进展[J].中国畜牧兽医，2010（11）.

[2]仇雪梅.影响生长核肉质性状的主要候选基因的研究[D].北京：中国农业大学，2004.

[3]GER BENS F，HARDER S F L，GROENEN M A，et al.A dimorphic microsatellite in the porcine H-FABP gene at chromosome 6[J].Anim Genet，1998a，29（5）：408.

[4]GER BENS F，JANSEN A，VAN ERP A J，et al.The adipocyte fatty acid-binding protein locus：characterization and association with intramuscular fat content in pigs[J]. Mamm Genome，1998b，9（12）：1 022-1 026.

[5]常国斌，周琼，栾德琴，等.鸡A-FABP基因不同基因型遗传效应及初步验证[J]，畜牧兽医学报，2011，42（8）：1088-1094.

[6]罗桂芬，陈继兰，孙世铎，等.鸡A-FABP基因多态性分析及其与脂肪性状的相关研究[C]∥中国家禽研究论文集，2005，43（9）：142-145.

[7]王启贵.鸡FABP基因克隆、表达特性及功能研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2004.

[8]杨霞，瞿浩，舒鼎铭等.鸡H-FABP基因外显子2的PCR-SSCP分析[J].四川农业大学学报，2006（2）.

[9]游小燕，刘益平，朱庆，等.鸡H-FABP基因多态性及其与屠宰性能的关联分析[J].遗传，2007（2）.

[10]屠云洁，王克华，苏一军，等.H-FABP基因在鹿苑鸡和隐性白羽鸡肉质中的差异表达[J].扬州大学学报:农业与生命科学版，2009（4）.

[11]赵衍铜.芦花鸡等三种优质肉鸡肌肉品质及H-FABP基因表达丰度的比较研究[D].等.长春：吉林大学，2013.

[12]王彦，朱庆，舒鼎铭，等.鸡H-FABP基因多态性及其与肌内脂肪含量的相关研究[J].中国畜牧杂志，2007（11）.

[13]LIVAK K J，SCHMITTHEN T.Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2（-Delta DeltaC（T））method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[14]VEERKAMP J H，MAAT MAN R.Cytoplasmic fatty acid binding proteins：Their structure and genes[J].Prog Lipid Res，1995，34：17-52.

[15]李俊英，李慧锋，姜润深，等.优质鸡肌内脂肪含量与屠体及肉质性状间的关系[J].中国畜牧杂志，2004，40（12）：12-15.

[16]陈继兰.肌肉肌苷酸和肌内脂肪含量遗传规律及相关候选基因的研究[D].北京：中国农业大学，2004.

[17]李文娟，李宏宾，文杰，等.鸡H-FABP和A-FABP基因表达与肌内脂肪含量相关研究[J]，畜牧兽医学报，2006，37（5），417-423.

[18]GERBENS F，VERBURG F J，Van Moer ker k H T B，etal.Asso ciations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs[J].J Anima l Science，2001，79（2）：347-354.

[19]韩光.冠型和H-FABP基因多态性与家鸡生产性能相关性的研究[D].石河子：石河子大学，2009.

[20]王彦.鸡H-FABP基因PCR-SSCP分析及其与脂肪性状的相关研究[D].雅安：四川农业大学，2006.

【责任编辑：吴跃新】

Study on SNP of A-FABP and H-FABP Genes in Huiyang Bearded Chicken

LI Hong-wei，CHEN Yuan，FAN Hong-ying
（Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

This study aims to analyze single nucleotide polymorphisms（SNP）of A-FABP and H-FABP genes which are associated with fat traits in order to find out the advantageous genotypes that maintain good-quality meat but also fast-growth for genotype selection in future.In this experiment，Huiyang bearded chickens were used as experimental material.DNA was extracted from the chickens’blood，followed by PCR amplification and sequencing，then single nucleotide polymorphisms of A-FABP and H-FABP genes were analyzed. Results show that:1）two base mutations were found in A-FABP gene:one in 1685 from C to T does not change the amino acid because it is not located in the coding region，but another in 1830 missing G，alter encoded amino acid that results in deleting D（asparagine），which leads to the change of spatial structure of A-FABP；2）two base mutations were found in H-FABP gene:one of them is not in the coding region，so there is no corresponding amino acid changes，and another in 746 from A to G results in lysine into glutamic，which changes the spatial structure of H-FABP.These results indicate that in Huiyang chickens，there exist single nucleotide polymorphisms of A-FABP and H-FABP genes，which will lay the theoretical foundation for genotype selection in the future.

Huiyang bearded chicken；A-FABP；H-FABP；SNP

S831.2

A

1671-5934（2016）03-0022-05

2016-04-20

广东省普通高校特色创新项目（2014KTSCX178）；惠州学院博士启动基金（156020021）

李红伟（1972-），男，云南禄丰县人，讲师，博士，研究方向为动物遗传育种。