水稻条纹叶枯病病毒检测技术及应用前景研究

陈丽君 马玉玲 包 蔚 何 锴 李念文 （上海市嘉定区农业技术推广服务中心 201800）

水稻条纹叶枯病病毒检测技术及应用前景研究

陈丽君 马玉玲 包 蔚 何 锴 李念文 （上海市嘉定区农业技术推广服务中心 201800）

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播引起的病毒病，其病原是条纹叶枯病毒，为有效防治水稻条纹叶枯病，亟需加强对条纹叶枯病毒的了解。现对水稻条纹叶枯病病毒的检测技术和应用前景进行了综述，包括间接ELISA法、斑点免疫结合(DIBA)法、RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术等。

水稻条纹叶枯病病毒；检测技术；应用前景

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播引起的水稻病毒病，有“水稻癌症”之称，该病广泛分布于日本、中国、韩国和南美等国家和地区[1]。水稻条纹叶枯病最早于1897年发现于日本关东地区，我国最早于1964年发现该病。近几年，随着气候环境的变化和种植结构的调整，国内水稻条纹叶枯病发病规模有不断扩大的趋势，目前，该病在我国16个省、市、自治区均有分布，其中以江苏、云南等地发生最为严重[2]。由于灰飞虱为水稻条纹叶枯病的主要传播媒介，属循回、增殖型传播，一旦染毒可持久性传播，并由雌虫经卵传播给下一代幼虫，因此，该病的发生与灰飞虱越冬虫量、虫口带毒率有很大关系。根据近几年的田间调查情况，由于灰飞虱越冬代虫源基数高、一代虫源发生量高及带毒率高、存活率高、绿肥种植面积增加、水稻播种期提前等因素，导致水稻条纹叶枯病在水稻上已普遍发生，严重影响了当前的水稻生产[3]。水稻条纹叶枯病的病原是条纹叶枯病毒（RSV），且为单链的RNA病毒，属纤细病毒属。和大部分RNA病毒一样，RSV有广泛的变异[4]，不同地区病株上的分离物在致病性、核酸序列等方面存在一定的差异。为有效防治该病，亟需加强对该病毒的了解，为此，笔者对水稻条纹叶枯病病毒的检测技术和应用前景进行了综述，以供参考。

1 检测技术

1.1 间接ELISA法

陈光育等[5]对间接ELISA法的具体检测步骤进行了描述，具体为：在普通多孔聚酯板上用100μL样品包被，4 ℃过夜或37 ℃ 2 h；加2%牛血清封闭液封闭，37 ℃ 0.5 h后，加入100μL单抗（用封闭液稀释40 000倍）37 ℃ 1 h；每孔用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(封闭液稀释5 000倍)孵育37 ℃ 1 h；底物液37 ℃显色0.5 h；加50μL 2 moL/L硫酸终止反应。每步用PBST洗涤3次，每次3 min。

1.2 斑点免疫结合(DIBA)法

周益军等[5]对斑点免疫结合(DIBA)法的具体检测步骤进行了描述，具体为：在杂交膜上划0.5 cm×0.5 cm方格，每格加入3μL样品室温晾干；加4%牛血清(或0.4%BSA)封闭37 ℃ 0.5 h后，浸入单抗(封闭液稀释10 000倍)中37℃ 1.5 h；用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(封闭液稀释5 000倍)孵育37 ℃ 1.5 h；洗涤后浸入固体显色底物液中，37 ℃ 0.5 h。每步用PBST洗涤3次，每次3 min。

1.3 RT-PCR技术

嵇朝球等[7]根据水稻条纹叶枯病病毒基因组序列的信息，通过在其外壳蛋白基因和毒蛋白基因的两侧设计两对引物，对提取的总RNA进行了RT-PCR扩增，扩增出水稻条纹叶枯病病毒基因组特有的2个条带，并通过测序和Genbank blast获得证实。

1.4 荧光定量RT-PCR技术

杨金广等[8]对Genbank中已有的水稻条纹叶枯病病毒CP基因进行了分析比较，选择CP最保守区域设计高特异性的引物，应用基于SYBR Green染料法的荧光定量RT-PCR技术进行检测。

2 应用前景

针对前4种检测技术，目前在生产中应用较广泛的是利用间接ELISA法和斑点免疫结合(DIBA)法来检测灰飞虱带毒率，进而对条纹叶枯病发生情况进行预测预报。这两种方法不仅拥有较高的准确性，同时还具有操作简便、快速和试验用具要求低等优点，适合在基层植保工作中推广使用。

随着分子生物学的发展，RT-PCR技术得到了迅速而广泛的应用，该技术可有效检测灰飞虱体内的病毒，进而测定灰飞虱群体的带毒率。与免疫法相比，该技术具有快速、灵敏和特异性强的优点，且不需要制备抗血清，适于普及应用。值得一提的是，该技术突破了仅可对灰飞虱虫体检测的局限，可对其主要的越冬寄主植物和水稻植株的病毒同时进行病毒检测，这是条纹叶枯病检测技术的一大突破，对于开展水稻条纹叶枯病的预测预报具有非常重要的现实意义。

荧光定量RT-PCR技术技术可快速、灵敏、准确地鉴定出2种及其以上品种的抗性差异，这为抗病品种鉴定和抗性种质资源的筛选提供了可靠的工具，该方法更适用于科学研究。

[1] 林奇英,谢联辉,周仲驹,等.水稻条纹叶枯病的研究.I.病害的分布和损失[J].福建农学院学报,1990,19(4)：421-425.

[2] 魏太云.水稻条纹病毒的基因组结构及其分子群体遗传[D].福州:福建农林大学,2003.

[3] 蒋耀培,李建刚,谭秀芳,等.上海地区水稻条纹叶枯病的发生与防治技术初探[J].上海农业科技,2005(5):37-38.

[4] 刘力,陈声祥,陈光堉,等.我国水稻条纹叶枯病病原性质的研究[J].病毒学杂志,1990(3):306-311.

[5] 陈光堉.酶联免疫吸附试验检测水稻条纹叶枯病介体昆虫带毒率[J].植物保护学报,1984(2）：73-78.

[6] 周益军,刘海建,王贵珍,等.灰飞虱携带的水稻条纹病毒免疫检测[J].江苏农业科学,2004(1）：50-51.

[7] 嵇朝球,钟环,钟佩英,等.水稻条纹叶枯病病毒RT-PCR快速检测研究[J].上海交通大学学报（农业科学版）,2005,23(2）：188-191.

2016-05-13