刺老苞总皂苷对抗大鼠泼尼松性骨质疏松的作用研究*

王萌萌，依香叫，崔 箭，裴凌鹏

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

刺老苞总皂苷对抗大鼠泼尼松性骨质疏松的作用研究*

王萌萌，依香叫，崔 箭，裴凌鹏△

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

目的:研究刺老苞总皂苷对泼尼松致大鼠骨质疏松的对抗作用。方法:将50只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、泼尼松模型组和刺老苞总皂苷高、中、低(10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg)剂量组各10只。分别灌胃相应药物，每日1次，连续8周后取血清检测生化指标，对骨进行组织切片检查及长度、宽度和骨质的测量。结果:泼尼松模型组大鼠股骨质量、尺骨骨羟脯氨酸(Hyp)和骨钙含量比正常对照组明显降低，胫骨骨髓腔中脂肪组织增多，血浆胆固醇(TG)含量上升，碱性磷酸酶(ALP)和高密度脂蛋白(HDL)含量下降。刺老苞总皂苷组能有效提高骨的质量和骨质的含量，减少骨髓腔中脂肪的含量，升高碱性磷酸酶和高密度脂蛋白含量。结论:泼尼松可抑制大鼠的骨生长及引起骨丢失，刺老苞总皂苷可有良好的对抗作用。

刺老苞;总皂苷;泼尼松;骨质疏松

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。影响骨形成与骨吸收的因素有很多，其中为治疗某些免疫性疾病所使用的肾上腺糖皮质激素就是导致继发性骨质疏松的诱因之一［1］。糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的激素，几乎影响全身所有的细胞和组织。该激素长期使用一方面促进骨骼的分解，使骨骼的生成减少;另一方面可对抗维生素 D的作用，使钙从尿中的排出增加，造成体内的钙大量丢失，最终形成骨质疏松［2］。因此，如何缓解临床长期使用糖皮质激素造成的骨质疏松症，一直以来是人们探讨的问题。近年来，传统中药(民族药)相继在此类疾病的预防与治疗研究中发现了很多确有疗效的化合物成分，再次引起了研究者的关注。刺老苞为五加科木属植物楤木(Aralia echinocauIis Hand.Mazz)及其变种白背叶木(Var.nuda Nakai)，其根皮或茎皮可入药，始载于《本草拾遗》，其味辛、性平，归肝、肾经，功能滋阴健肾、祛风湿、壮筋骨、散瘀血、消肿毒，可用于风湿痹痛、跌打损伤、骨折等治疗［3］。本试验通过长期服用泼尼松(一类中效糖皮质激素)引发大鼠骨质疏松模型，并以此模型来研究刺老苞总皂苷可能的作用效果与调控机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

全自动生化分析仪(奥林巴斯公司)，Labconco冰冻真空干燥仪(法国乐高公司)，J2-SH高速冰冻离心机(日本岛津公司)，752分光光度计(中国伯乐公司)，刺老苞(湖北恩施医药公司)，醋酸泼尼松、钙黄绿素、盐酸四环素、Goldners染料、总皂苷标准品(美国 SIGMA公司)，Hyp、HDL-C、ALP、TG试剂盒(北京中生生物工程高技术公司)。

1.2 刺老苞总皂苷制备

1000 g刺老苞晒干后研磨→70%乙醇60 ml回流提取4 h→离心→大孔吸附树脂柱分离→水洗脱→乙醇洗脱→减压浓缩→冰冻真空干燥。样品经HPLC及其光谱特征峰与标准品比对鉴定为刺老苞总皂苷，纯度为95%。

1.3 动物模型建立与分组

SD大鼠50只按随机数字表法分为正常对照组、模型组以及刺老苞总皂苷高、中、低剂量组每组各10只。除正常对照组外，其余各组给予5 mg/kg泼尼松1 h处理，刺老苞总皂苷高、中、低剂量组分别进行30 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌胃，给药量为5 ml/kg，正常对照组与模型组均给予5 ml/kg生理盐水灌胃。每日灌胃1次，连续8周。第2周末各组大鼠进行第1次荧光标记(即颈皮下注射盐酸四环素2.5 mg/kg)，在第7周末再进行第2次荧光标记(即颈皮下注射钙黄绿素5 mg/kg)。

1.4 观察指标

1.4.1 骨物理指标及血清生化指标的观察动物处死后分离血清，按照试剂盒依次测量 HDLC、TG及钙、磷、ALP含量。剥离左侧股骨，称量湿重后烤干至恒重，分别测量骨长(即股骨大转子和股骨颈汇合处最低点到股骨踝间窝的距离)与骨宽(即股骨曲面的第三转子下行至股骨干交接处)。

1.4.2 骨生化指标的观察 取左侧尺骨称重研碎、灰化2 h，取出骨灰硝酸溶解。经处理后，火焰原子吸收分光光度计测定钙、磷含量。

1.4.3 骨中羟脯氨酸的含量 取右侧尺骨上端称重研碎，采用氯胺T法测定羟脯氨酸含量［4］。

1.4.4 骨组织构成的观察 取胫骨上段不脱钙骨部分，经图像软件分析髓腔脂肪细胞、血窦和红骨髓面积比。骨髓腔面积=红骨髓面积+白骨髓面积(即脂肪组织面积+血窦面积)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，组间差异比较用单因素方差分析，以均数±标准差(珋x± s)表示，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 股骨物理指标变化

表1显示，与正常对照组比较，模型组股骨湿重、干重均明显降低(P＜0.01)，表明长期泼尼松使用可引发骨质显著变化，但骨长度、宽度无明显变化。刺老苞总皂苷不同剂量组的股骨湿重、干重均明显升高(P＜0.01)，但各剂量组之间比较差异无统计学意义。

表1 股骨物理指标变化(±s)

表1 股骨物理指标变化(±s)

注:与正常对照组比较:▲▲P＜0.01;与泼尼松模型组比较:##P＜0.01

组别 例数 湿重(mg) 干重(mg) 骨长度(mm) 骨宽度(mm)正 常 对 照 组34.2±0.5 4.3±0.4 10 908.6±20.1 730.5±17.7 34.5±0.6 4.3±0.3泼 尼 松 模 型 组 10 777.1±17.1▲▲ 554.7±16.5▲▲ 33.7±0.5 4.1±0.2刺老苞总皂苷低剂量组(10mg/kg) 10 820.2±18.2## 660.3±17.1## 33.9±0.5 4.1±0.3刺老苞总皂苷中剂量组(20mg/kg) 10 869.7±19.0## 682.5±17.3## 34.1±0.6 4.2±0.3刺老苞总皂苷高剂量组(30mg/kg) 10 890.3±19.3## 696.1±17.7##

2.2 血清生化指标的影响

表2显示，与正常对照组比较，模型组血钙、TG含量有所升高(P＜0.01)，而HDL、血磷、ALP含量有所下降(P＜0.01)。与模型组比较，刺老苞总皂苷不同剂量组均明显升高HDL、血磷、ALP含量(P＜0.01)，降低TG含量(P＜0.01)。

表2 血清生化指标变化(±s)

表2 血清生化指标变化(±s)

注:与正常对照组比较:▲▲P＜0.01;与泼尼松模型组比较:##P＜0.01

组别 例数 血钙(mmol/L)血磷(mmol/L) ALP (IU/L) HDL (mg/dL) TG (mg/dL)正 常 对 照 组 10 2.5±0.3 2.7±0.3 119.5±18.2 55.8±2.5 143.8±23.3泼 尼 松 模 型 组 10 2.9±0.3▲▲ 1.8±0.2▲▲ 76.0±14.1▲▲ 34.4±2.2▲▲ 178.5±30.1▲▲刺 老 苞 总 皂 苷 10 2.8±0.5 2.2±0.3## 104.0±15.5## 45.1±2.2## 151.8±24.4##低 剂 量 组 (10 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 2.8±0.5 2.2±0.3## 109.8±16.1## 48.9±2.5## 146.1±23.2##中 剂 量 组 (20 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 2.7±0.4 2.4±0.3## 113.5±17.0## 52.8±2.2## 144.8±24.5##高 剂 量 组 (30 mg/kg)

2.3 尺骨生化指标变化

表3显示，与正常对照组比较，模型组尺骨质量、Hyp、Ca、P含量均明显降低(P＜0.01)，表明长期使用泼尼松可引发骨有机质丧失。与模型组比较，刺老苞总皂苷不同剂量组均可增加尺骨质量和Hyp、Ca、P含量(P＜0.01)。

表3 尺骨生化指标变化(±s)

表3 尺骨生化指标变化(±s)

注:与正常对照组比较:▲▲P＜0.01;与泼尼松模型组比较:##P＜0.01

组别 例数 骨重(mg) 羟脯氨酸(μg/mL) Ca(μg/mL) P(μg/mL)正 常 对 照 组 10 179.3±18.8 123.2±14.0 640.0±23.2 250.9±22.1泼 尼 松 模 型 组 10 140.1±17.2▲▲ 91.9±13.1▲▲ 600.1±22.0▲▲ 201.3±21.1▲▲刺 老 苞 总 皂 苷 10 145.9±18.3## 100.2±13.3## 615.9±23.0## 220.8±22.0##低 剂 量 组 (10 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 158.8±18.0## 107.1±14.0## 619.2±22.1## 233.0±22.2##中 剂 量 组 (20 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 169.1±18.5## 119.1±13.9## 623.5±23.2## 237.9±23.0##高 剂 量 组 (30 mg/kg)

2.4 胫骨骨组织构成变化

表4显示，与正常对照组比较，模型组胫骨骨髓腔中骨髓面积增加而红骨髓减少(P＜0.01)，白骨髓中脂肪组织增多(P＜0.01)，表明泼尼松可引发大鼠骨髓的脂肪化。与模型组比较，刺老苞总皂苷不同剂量组均可使骨髓腔内脂肪组织减少，血窦组织增加(P＜0.01，P＜0.01)。

表4 胫骨骨髓组织构成面积百分率变化(±s)

表4 胫骨骨髓组织构成面积百分率变化(±s)

注:与正常对照组比较:▲▲P＜0.01;与泼尼松模型组比较:##P＜0.01

组别 例数 红骨髓(%) 白骨髓(%) 脂肪组织(%) 血窦组织 (%) 10 73.0±5.7 22.0±3.1 17.2±2.3 15.9±2.3泼 尼 松 模 型 组 10 49.0±4.0▲▲ 47.1±4.0▲▲ 33.2±3.0▲▲ 12.3±2.1▲▲刺 老 苞 总 皂 苷 10 70.9±5.3## 31.0±3.0## 13.2±2.2## 15.0±2.0##低 剂 量 组 (10 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 72.3±5.1## 28.3±3.4## 14.6±2.2## 15.2±2.2##中 剂 量 组 (20 mg/kg)刺 老 苞 总 皂 苷 10 74.1±5.6## 25.7±3.2## 15.7±2.1## 15.5±2.3##高 剂 量 组 (30 mg/kg)正 常 对 照 组

3 讨论

糖皮质激素(glucocorticoid，GCS)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素，主要为皮质醇(cortisol)，具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。此类激素目前主要分为内源性(如可的松、氢化可的松)与外源性(泼尼松、地塞米松等)，临床上长期使用可导致严重的骨性合并症(如骨质疏松及椎骨压迫性骨折)，并伴有股骨头坏死［5］。研究表明，泼尼松长期使用可诱发大鼠负重骨的骨量丢失，松质骨结构发生明显变化，骨的脆性增高、韧性下降，骨质减退，呈现骨质疏松状态，且病变程度与泼尼松使用剂量呈正相关性。与此同时，泼尼松长期使用可增强大鼠破骨细胞活性，促进骨吸收过程，加速骨质溶解，抑制骨细胞分泌骨质，并引起体内脂质代谢紊乱，造成骨髓脂肪细胞增多，引起骨髓腔内压增高而使血流减慢，从而影响了骨内血供而抑制骨代谢有关［6-10］。从本实验结果初步证实，长期服用泼尼松确实可诱发 SD大鼠骨质疏松症的发生，其各项骨组织与血清生化、物理指数与以往报道结果基本一致［11］。与模型组比较，不同剂量刺老苞总皂苷灌胃后的SD骨质疏松症大鼠可不同程度上有效改善与影响上述各项指数，治疗骨质疏松症与影响其病程发展，但就其作用机制尚需进一步的研究。

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Study on the Effect of Total Saponins of Old Thorn Bract on Rat Osteoporosis Induced by Prednisone

WANG Meng-meng，YI Xiang-jiao，CUI Jian，PEI Ling-peng△
(MINZU University，Institute of Minority Traditional Medicine Research，Beijing 100081，China)

Objective:To investigate the effect of Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin on osteoporosis，which was induced by prednisone in rats.Methods:Fifty SD rats were randomly divided into control group，prednisone group，Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin low dosage group(10 mg/kg)，middle dosage group(20 mg/kg)and high dosage group(30 mg/kg).Rats in the control group were treated with dissolvent，the others were treated with prednisone firstly，and then，the rats in prednisone group were treated with dissolvent，the Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin different groups were treated with related dosage extracts，respectively，once a day.After 8 weeks，the bone histomorphometric analysis of thighbone was performed，the content of Ca，P and hydroxyproline(Hyp)in ulna were measured，the length and width of the thighbone were tested.Results:The bone weight，bone Hyp and bone Ca in prednisone group were lower than those in control group.The fat in the marrow，the cholesterol in marrow increased but alkaline phosphatase(ALP)and high-density-lipoprotein(HDL)were reduced.Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin can increase bone weight，reduce the fat in the marrow and increase the ALP and HDL.Conclusion:Prednisone can restrain bone growth and increase bone loss，while Aralia echinocauIis Hand.Mazz total saponin has good protective effect.

Aralia echinocauIis Hand.Mazz;Total saponin;Prednisone;Osteoporosis

R274.9

:B

:1006-3250(2016)04-0477-03

2015-08-20

国家自然科学基金资助项目(81173361，81270051，81473451)-基于骨血管重构耦联信号网络探讨刺老苞根皮有效成分群干预骨折愈合的分子机制，基于Wnt/β-catenin与TGF-β/BMPs信号耦联网络的刺老苞根皮干预骨折愈合分子机制研究，基于3D打印技术与分子信号网络理论研究刺老苞根皮有效成分群调控骨折愈合作用机制

王萌萌(1979-)，女，山东人，在读博士，从事民族医药的研究。

△通讯作者:裴凌鹏(1976-)，男，湖南人，副研究员，医学博士，从事民族药与临床医学研究，Tel:13520801809，E-mail: lppei@hotmail.com。