CaM/CaMKⅡ在脾气虚证大鼠脑肠微环境中的表达及四君子汤干预效应研究*

田 茸，巩子汉，杨晓轶，朱立鸣，段永强，成映霞，杜 娟，王 燕

(1.成都中医药大学，成都 611137;2.甘肃中医学院，兰州 730020)

【实验研究】

CaM/CaMKⅡ在脾气虚证大鼠脑肠微环境中的表达及四君子汤干预效应研究*

田 茸1，巩子汉2，杨晓轶2，朱立鸣2，段永强2，成映霞2，杜 娟2，王 燕2

(1.成都中医药大学，成都 611137;2.甘肃中医学院，兰州 730020)

目的:从CaM信号通路关键基因揭示脾气虚证发生及益气健脾法干预作用机制。方法:脾气虚证大鼠为研究对象，采用实时荧光定量RT-PCR、Western Blot技术检测不同阶段大鼠脑、肠CaM信号通路关键基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的动态表达，并分析四君子汤干预效应机制。结果:从大鼠小肠组织看，脾气虚证大鼠相对于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表达升高，经四君子汤治疗后明显降低;从大鼠脑组织看，脾气虚证大鼠相对于正常大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白表达降低，经四君子汤治疗后明显升高。结论:脑肠微环境中CaM信号传导通路关键基因CaM/CaMKⅡ的动态表达与脾气虚证形成有关，四君子汤通过影响其表达对脾气虚证起到时相性动态干预。

脾气虚证;四君子汤;脑;肠;CaM;CaMKⅡ

中医学归纳“脾”为气血生化之源、后天之本，主司运化、主统血、主肌肉四肢，脾气虚证以面黄食少、泄泻或便秘、神疲乏力、少气懒言、舌淡苔白、脉虚弱为临床辨证要点。故脾气虚证是以消化吸收功能障碍为主要表现，并涉及神经、免疫、内分泌、运动等系统调节紊乱、营养物质代谢低下的虚损性疾病状态，是多系统和多器官功能衰弱的综合病理变化［1］。鉴于中医之“脾”是以消化系统为主体，并涉及多系统的综合功能性单位，故本研究将靶标定位到脑、肠微环境下，分别检测大鼠脑和小肠CaM信号通路关键基因CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表达，从而探讨脾气虚证的形成机制，并在此基础上探讨四君子汤对脾气虚证的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

采用SPF级 Wistar雄性大鼠，体质量(170± 20)g，由甘肃中医学院医学实验中心提供(动物合格证号 SCXK［甘］2011-0001-0001011)。大鼠适应性饲养3 d后，按体质量编号依照随机数字表法分为正常对照组、模型14 d组、模型21 d组、模型28 d组、四君子汤14 d组、四君子汤21 d组、四君子汤28 d组，分笼饲养。

1.2 药物及试剂

造模药材大黄、枳实、厚朴(4∶2∶3)，灌胃药材人参、白术、茯苓、炙甘草(3∶3∶3∶2)，购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，常规煎煮，滤液浓缩至折合原药材质量浓度2 g/ml备用。主要实验试剂:辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L，批号ZB-2301)，Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co Ltd;总蛋白提取试剂盒(批号 PC0020)，北京普利莱基因技术有限公司;蛋白质定量试剂盒(BCA法，批号P1511)，北京普利莱基因技术有限公司;反转录试剂盒(批号0000036802)，美国 Promega公司;实时荧光 定 量 PCR 试 剂 盒 (批 号 0000036802，0000042197)，美国 Promega公司;Cam、CaMKⅡ引物，宝生物工程(大连)有限公司;Anti-Calmodulin antibody，Rabbit monoclonal［EP799Y］to Calmodulin，ab45689)，abcam公司(1/1000-1/5000);Anti-CaMKⅡ antibody:Rabbit monoclonal［EP1829Y］to CaMKⅡ，ab52476)，abcam公司(1/20000)。

1.3 模型复制及给药

1.3.1 模型复制 以苦寒破气加游泳力竭双因素法复制脾气虚证模型。苦寒破气法:模型组大鼠每日按7.5 g/kg·d大黄枳实厚朴制剂液灌胃;游泳力竭法:大鼠每日负重游泳，于大鼠尾根部缠绕质量为该大鼠体质量 10% 的保险丝，放入水深 50 cm、20℃的水槽中游泳，以游泳力竭(即大鼠鼻尖没入水面10 s)为度，判定游泳力竭。脾气虚证模型复制成功评估标准依据卫生部药政局颁布的《中药治疗脾气虚证的临床研究指导原则》拟定:①蜷缩扎堆1分;②眯眼弓背1分;③食量减少1分;④体质量减轻1分;⑤便形质软1分;⑥便形溏稀2分;⑦肛温下降2分;⑧游泳耐力下降1分。9项症状表现中出现6项则可判断为脾气虚证。结合评估标准以及大鼠体质量增长幅度、进食量、游泳力竭时间、胃残留率、小肠推进率等定量指标评判大鼠脾气虚证模型复制成功。

1.3.2 分组给药 各四君子汤组大鼠在造模7 d后继续造模的同时，每天以四君子汤20 g/kg·d药剂灌胃进行干预治疗，灌胃容积均为1 ml/100 g，连续灌胃3周(四君子汤用药量以临床等效剂量为标准，实验等效剂量按人与动物体型系数折算［2］，相当于60 kg成人每日临床用量的10倍)。正常对照组、各模型组以相应等体积的蒸馏水灌胃28 d。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 取材 实验于14 d、21 d、28 d末分别断椎处死相关组别大鼠，冰台上迅速取脑，分离海马组织，并截取十二指肠上段组织备用。

1.4.2 实时荧光定量 PCR检测各组大鼠小肠、脑组织CaM/CaMKⅡ基因表达 组织总RNA提取与质量检测及反转录合成模板 cDNA:取适量各样本组织，分别取1 μL各组织RNA样品用核酸定量分析仪测定其 OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。按照反转录试剂盒要求操作，所得的单链 cDNA放置于－20℃保存备用。引物设计与实时荧光定量PCR:从NCBI中查寻目标基因ID及序列，由TAKARA公司设计和合成目标基因引物。β-actin引物序列，上游:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游:5'-GAC TCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，扩增长度:150 bp; CaM引物序列，上游:5'-TCAGAACCCAACAGAGG CTGAA-3'，下游:5'-GTCAAAGACTCGGAATGCCT CAC-3'，扩增长度:160 bp;CaMKII引物序列，上游: 5'-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3'，下游:5'-ATGT AGGCGATGCAGGCTGAC-3'，扩增长度:183 bp。实时荧光定量PCR以β-Actin作为内参基因，得到各扩增反应的Ct值。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和 β-actin的Ct值，用比较Ct值法计算相对表达量。

1.4.3 Western blot检测各组大鼠小肠、脑组织CaM/CaMKⅡ蛋白表达 组织蛋白提取:分别将小肠、脑组织裂解剪成碎片匀浆，直至95%的细胞被破碎，离心后吸取上清液得组织总蛋白产物并蛋白纯化。蛋白定量:组织蛋白定量检测采用 BCA (Bicinchoninic acid)蛋白质测定方法，以 BSA标准蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据所测样本的吸光度值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量;样本组织蛋白变性:分别取各组织样本300 μL于离心管中，再加入100 μL 4×SDSPAGE蛋白上样缓冲液充分混匀，沸水(100℃)中水浴10 min冰水浴冷却，－20℃冰箱保存;溶液配制;制胶与电泳;转膜结束后，打开转移夹，PVDF膜上可见清晰的预染 Marker，表明蛋白已转移至PVDF膜上，根据抗体说明中目标抗体的分子量分大小确定目标蛋白位置;免疫检测:将PVDF膜放入适量封闭液中，37℃恒温水浴摇床上封闭2 h，放入平皿中，并加入相应的一抗溶液(GAPDH一抗溶液配制(1∶700):牛奶封闭液7 ml，GAPDH一抗10 ul; CamKⅡ一抗溶液配制(1∶10000):封闭液10 ml，CamKⅡ一抗1 ul;Cam一抗溶液配制(1∶500):封闭液5 ml，Cam一抗1 ul、37℃恒温水浴摇床上封闭2 h，再将PVDF膜放置于10 mlTBST溶液中，摇床上洗膜3次、10 min/次，将洗好的 PVDF膜放于配制好的二抗溶液(二抗溶液配制:辣根酶标记山羊抗兔(1∶7500):山羊抗兔二抗 2 μL，牛奶封闭液 15 ml)，摇床上孵育2 h再洗膜;采用 ECL法显色，并根据不同显影光强度调整曝光条件，用 Bio-RAD Quantity one图像分析软件进行扫描分析。结果用Quantity one分析光密度值对蛋白含量进行分析，以β-actin与目的蛋白密度比值作为待测目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示。首先进行正态性、方差齐性检验，满足正态性者不同组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般情况改变

正常对照组大鼠饮食、活动、大便性状及毛发等均无异常，体质量稳定逐渐增加。各模型组大鼠从14 d开始逐渐出现活动减少、毛发枯槁(背脊毛色从白到红再转黄)，逐渐出现眯眼弓背，喜扎堆，体质量下降，进食量减少，大便稀软;造模21 d后部分大鼠出现大便稀溏，少数出现水样便或肛门脱垂;造模28 d多数大鼠便质清稀，少数出现便秘。各四君子汤组大鼠的一般情况均较模型组有所改善，并随着治疗时间的延长，大鼠进食量增加、活动增多，眯眼弓背和扎堆现象减少，大便性状接近正常。

2.2 各组大鼠体质量、进食量、游泳力竭时间的动态变化

表1显示，模型组大鼠在造模14 d时与正常对照组比较，体质量、进食量、游泳力竭时间均明显偏低(P＜0.01，P＜0.05);随造模时间延长，此3项指标均呈下降趋势，明显落后于正常对照组(P＜0.01)。四君子汤组在造模和治疗初期与正常对照组比较，体质量、进食量、游泳力竭时间明显偏低(P＜0.01，P＜0.05)，经过28 d的治疗，体质量增长幅度至每7 d增长13～15 g，但由于体质量基数低，故仍低于正常对照组(P＜0.01)却明显高于模型组(P＜0.01)，每日进食量及游泳力竭时间均有所增加，基本接近正常对照组且高于模型组(P＜0.01)。

表1 治疗14 d大鼠体质量、进食量、游泳时间表

2.3 各组大鼠胃残留率、小肠推进率动态变化

表2显示，随造模时间延长模型组大鼠与正常对照组比较，胃残留率、小肠推进率呈升高趋势，到28 d时均明显高于正常对照组(P＜0.01，P＜0.05);四君子汤组在造模和治疗初期与正常对照组比较，胃残留率略低，小肠推进率略高，但差异无统计学意义。经过28 d的治疗，胃残留率、小肠推进率有所降低，均明显低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。

表2 各组大鼠胃残留率、小肠推进率比较

2.3 各组大鼠脑、小肠组织 CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相对表达量 表3、4显示，通过实时荧光定量RT-PCR和Western Blot技术检测显示，脑组织中模型组大鼠CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白的表达随造模时间的延长呈下降趋势，在造模第21、28天时，其表达明显低于正常对照组(P＜0.01)。四君子汤组在治疗初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表达也略低于正常对照组，随治疗时间的延长表达逐渐升高，至治疗第21、28天时其表达明显高于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。从小肠组织看，模型组大鼠CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白相对表达，随造模时间的延长呈上升趋势，在造模第21、28天时其表达明显高于正常对照组(P＜0.01，P＜0.05)。四君子汤组在治疗初期，CaM/CaMKⅡ mRNA和蛋白表达也略高于正常对照组，随着治疗时间的延长表达逐渐降低，至治疗第21、28天时其表达明显低于模型组(P＜0.01)。

3 讨论

中医证候的客观化研究是中医学发展和完善的前提和基础。脾气虚证是脾病辨证中的基础证，加之脾气虚证牵涉多脏器、多系统，故本课题基于细胞信号传导理论，将与机体多系统多脏器生理功能密切相关的钙调蛋白信号传导途径关键基因CaM/CaMKⅡ的表达作为检测指标，提出“CaM信号传导途径在脾气虚证脑肠微环境中的可能作用机制”工作假说，从而对脾气虚证证候实质进行客观化研究。

表3 各组大鼠脑、小肠组织CaM/CaMKⅡmRNA相对表达量比较

表4 各组大鼠脑、小肠组织CaM/CaMKⅡ蛋白相对表达量比较

研究结果证明，复制脾气虚证模型的大黄枳实厚朴活性物质苦寒破气，有可能影响到胃蠕动，使胃排空时间延长并导致食积，同时又兴奋小肠平滑肌，使得小肠收缩功能亢进导致泄泻，说明大黄枳实厚朴成功复制了脾气虚证模型，模拟了脾气虚证患者的神疲乏力、少气懒言、倦卧多寐、胃纳不香、纳食减少、停食积食、大便稀溏及小儿出现生长发育迟缓等症状。经过四君子汤活性物质益气健脾，促进胃蠕动，缩短胃排空时间，减少食积的发生，同时调节小肠的推进功能，加强小肠对营养物质的吸收，从而改善大鼠的一般情况，恢复体质量增长幅度，加强运动耐力并改善便质，说明四君子汤能从整体上改善脾气虚证患者的一般情况，对脾气虚证相应症状都有很好的治疗效果。

从证候实质的角度发现，脾气虚证证候与脑肠中CaM/CaMKⅡmRNA和蛋白的表达水平之间存在动态多时相效应关系，即脾气虚证大鼠随造模时间的延长，与正常大鼠比较小肠组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达明显升高，脑组织中 CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达明显降低，说明大黄枳实厚朴活性物质具有增强大鼠小肠组织中CaM/ CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达，并抑制大鼠脑组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达的作用，揭示了脾气虚证证候的细胞信号通讯机制。与此同时，在遵循传统中医治则治法理论基础上，通过观察益气健脾法的代表方剂四君子汤对脾气虚证大鼠的干预作用发现，随四君子汤治疗时间的延长，与脾气虚证大鼠比较治疗后大鼠小肠组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达明显降低，脑组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达明显升高，说明四君子汤活性物质具有抑制脾气虚证大鼠小肠组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达，并促进脾气虚证大鼠脑组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达的作用。从基因和蛋白水平探寻到中医药治疗脾气虚证证候的作用靶位和机制，为今后进一步揭示中医药治疗脾气虚证多时相、多靶点的科学内涵打下基础。

［1］ 钱泽南，钱会南.脾气虚证与神经-内分泌-免疫调节相关机制研究［J］.辽宁中医杂志，2010，37(3):401-403.

［2］ 陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1993:33-34.

Expression of CaM/CaMK II and the Intervention effect of Si Jun Zi Decoction in the Brain and Intestine Micro-environment of Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

TIAN Rong1，GONG Zi-han2，YANG Xiao-yi2，ZHU Li-ming2，DUAN Yong-qiang2，CHENG Ying-xia2，DU Juan2，WANG Yan2
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China; 2.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)

Objective:To reveal the mechanism about the expressions of key genes of CaM signal pathway of the spleen qi deficiency rats，and the intervention effects about strengthening spleen and benefiting qi.Methods:We took the spleen qi deficiency rats as the targets，We detected dynamic expressions of critical genes CaM/CaMKⅡmRNA and protein on CaM signaling pathway in brain and intestine microenvironments at different time by technique methods of real-time quantitative RT-PCR and Western Blot.At the same time we studied on the intervention effect mechanism of Sijunzi Decoction to treat spleen qi deficiency rats.Results:1 Rat intestinal detection index:Spleen qi deficiency rats intestinal CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats intestinal CaM/ CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with spleen qi deficiency rats.2 Rat brain detection index: Spleen qi deficiency rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions reduced compared with normal rats.After the treatment of Sijunzi Decoction rats brain CaM/CaMKⅡmRNA and proteins expressions increased compared with spleen qi deficiency rats.Conclusions:The dynamic expressions of key genes CaM/CaMKⅡof CaM signal pathway in brain and intestine microenvironment，which is the basis for spleen qi deficiency syndrome.Sijunzi Decoction treated spleen qi deficiency by affecting the dynamic expressions of CaM/CaMKⅡ.

Spleen deficiency;Sijunzi Decoction;Brain;Intestine;CaM;CaMK Ⅱ

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0468-04

2015-08-06

国家自然科学基金资助项目(81160420);甘肃省自然科学基金资助项目(1010RJZA148);甘肃省教育厅基金资助项目(1006-05)

田 茸(1978-)，女，主治医师，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事中医药防治脾胃病的临床与实验研究。