反相高效液相色谱法同时测定香菊胶囊中绿原酸和咖啡酸含量

孙 菲，孙 欣，金 荣

(黑龙江省鸡西市食品药品检验检测中心，黑龙江 鸡西 158100)

反相高效液相色谱法同时测定香菊胶囊中绿原酸和咖啡酸含量

孙 菲，孙 欣，金 荣

(黑龙江省鸡西市食品药品检验检测中心，黑龙江 鸡西 158100)

目的 建立同时测定香菊胶囊中绿原酸和咖啡酸含量的反相高效液相色谱法。方法 色谱柱采用Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流动相为乙腈－甲醇－0．2%磷酸溶液(线性梯度洗脱)，检测波长328 nm，流速1．0 mL／min，进样量20 L，柱温 30℃。结果 绿原酸和咖啡酸进样量分别在2．034×10－2～5．085×10－1g(r＝0．999 9，n＝7)和 2．218×10－2～5．545×10－1g (r＝0．999 9，n＝7）时与峰面积线性关系良好，加样回收率分别为98．83%和98．72%(RSD分别为0．86%，0．88%，n＝6)。结论 该法操作快速、简便、准确、结果可靠，可用于香菊胶囊的质量控制。

香菊胶囊；含量测定；绿原酸；咖啡酸；高效液相色谱法

香菊胶囊由化香树果序（除去种子）、夏枯草、野菊花、黄芪、辛夷、防风、白芷、甘草、川芎9味中药组方，具有辛散祛风、清热通窍之功效[1]，用于急、慢性鼻窦炎及鼻炎的疗效显著[2]。现行质量标准仅有黄芪有效成分黄芪甲苷的含量测定，无对处方中主要成分野菊花的质量控制方法。绿原酸和咖啡酸为野菊花中的有效成分[3－4]，两者含量可以作为香菊胶囊中野菊花质量好坏的评定依据。目前，尚无文献报道香菊胶囊中绿原酸和咖啡酸的含量测定方法。为此，笔者建立了同时测定香菊胶囊中绿原酸和咖啡酸含量的高效液相色谱法，专属性强，可为香菊胶囊中野菊花的质量控制提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

HP 1100型高效液相色谱仪，包括四元泵、紫外检测器、自动进样器、HP 1100工作站；XSE 205型电子天平（METTLER TOLEDO公司）；JAC－40型超声波清洗器（功率100 W，频率40 kHz，济宁市奥波超声电气有限公司）；UV－2550型紫外－可见分光光度计（岛津仪器＜苏州＞有限公司）。

1．2 试药

咖啡酸对照品（批号为110885－201102，中国药品生物制品检定所）；绿原酸对照品（批号为 110753－201314，中国药品生物制品检定所，含量为96．6%）；香菊胶囊（批号140416，140418，140312，山东步长制药有限公司）；水为纯化水，其他试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：AgilentZorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A)－甲醇（B）－0．2%磷酸溶液(C)，线性梯度洗脱，5%A－5%B（0 min），5%A－5%B（30 min），20%A－20%B（40 min），5%A－5%B（50 min），5%A－5%B（60 min）；检测波长：328 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL；流速：1．0 mL／min。在此条件下，绿原酸和咖啡酸色谱峰的分离度大于1．5，理论板数以咖啡酸色谱峰计不低于4 000。色谱图见图1。

2．2 溶液制备

分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的咖啡酸和绿原酸对照品11．09 mg和10．53 mg（含量为96．6%），置同一10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，用甲醇稀释至刻度，作为混合对照品贮备液。

精密称取香菊胶囊样品适量（约1 g），置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液35 mL，超声提取35 min（功率为100 W，频率为40 kHz），放置20 min，冷却至室温，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，备用，得供试品溶液。

按香菊胶囊的处方[5]和工艺，不加入野菊花药材，依法制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取混合对照品贮备液2．0 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过。按拟订色谱条件，分别进样1，2，4，8，12，16，25 μL，以峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得回归方程，绿原酸：Y＝2．839×103X－1．683，r＝0．999 9（n＝7），绿原酸进样量在 2．034×10－2～5．085×10－1μg范围内与峰面积线性关系良好；咖啡酸：Y＝5．075×103X－1．316，r＝0．999 9（n＝7），咖啡酸进样量在2．218×10－2～5．545×10－1μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取混合对照品贮备液1．0 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，得绿原酸和咖啡酸质量浓度分别为20．34和22．18 μg／mL的混合对照溶液，按拟订色谱条件，连续重复进样5次，每次 20 μL，记录色谱峰面积，结果的 RSD分别为0．4%和0．3%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密称取香菊胶囊样品适量，按供试品溶液制备溶液，按拟订色谱条件，设定自动进样器，分别于0，1，2，4，10，16，24 h时重复进样，每次20 μL，记录色谱峰面积。结果的 RSD分别为0．7%和 0．3%（n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取香菊胶囊（批号为140416）适量，依法制备供试品溶液5份，按拟订色谱条件，分别进样，测定色谱峰面积。结果每粒胶囊中绿原酸和咖啡酸的平均含量分别为0．148 mg和0．091 mg，RSD分别为0．7%和0．5%（n＝5），表明方法重复性较好。

加样回收试验：分别精密称取香菊胶囊（批号为140416）0．16 g，称取6份，分别置50 mL容量瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液（质量浓度为37．05 μg／mL）和咖啡酸对照品溶液（质量浓度为 22．18 μg／mL）各2．0 mL，加50%甲醇溶液适量，超声提取35 min，静置至室温，加50%甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，分别进样20 μL，记录色谱峰面积，测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验测定结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取3批市售样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别进样，记录色谱峰面积，以峰面积外标法计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3．1 测定波长确定

分别取绿原酸、咖啡酸对照品适量，用流动相制成一定质量浓度的对照品溶液，依照紫外分光光度法，分别于200～700 nm波长范围内扫描。结果表明，咖啡酸和绿原酸的最大吸收波长分别为323 nm和328 nm，选择328 nm波长时分离效果更好。

3．2 色谱条件筛选

流动相分别考察了甲醇－0．2%磷酸溶液、乙腈－0．2%磷酸溶液、甲醇－乙腈－0．2%磷酸溶液，结果以甲醇－0．2%磷酸溶液、乙腈－0．2%磷酸溶液二元体系的流动相进行线性梯度洗脱，绿原酸和咖啡酸分离效果不理想，分离度不符合要求；以甲醇－乙腈－0．2%磷酸溶液三元体系流动相梯度洗脱绿原酸和咖啡酸分离较好，柱效高。另外，绿原酸性质不稳定，见光易分解[6]，应当全部采用棕色瓶，并注意避光。

3．3 提取方法考察

分别以20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇作溶剂超声提取30 min，测定绿原酸和咖啡酸的含量。以50%甲醇为溶剂时，提取效果好，与文献[7]结果相同。另外，以50%甲醇为溶剂溶解样品，分别超声提取10，20，30，35，40，50 min，结果超声35 min提取完全。

3．4 试验不足

野菊花作为香菊胶囊处方中的臣药，其质量直接影响药效，绿原酸、咖啡酸和蒙花苷为野菊花中重要的指标成分，因蒙花苷在该色谱条件下保留时间较长，本试验中未能建立同时测定野菊花中3种成分的方法，蒙花苷可选用其他色谱条件单独测定含量。

[1]WS3－161(Z－151)－2001(Z)，国家药品标准·新药转正标准[S]．

[2]王桂安，李 歌，杜 蕾，等．香菊胶囊治疗慢性鼻－鼻窦炎的临床疗效分析[J]．中国医药指南，2013，11(1):598－600．

[3]郭巧生，房海灵，申海进．不同产地野菊花中绿原酸、咖啡酸和蒙花苷含量测定[J]．中国中药杂志，2010，35（9）：1 160－1 162．

[4]彭 朋，程雪梅，刘 力，等 ．野菊花提取物的质量标准研究[J]．中国药事，2010，24(7):650－654．

[5]王 珂，雷国莲，王西芳，等．微波干燥应用在香菊胶囊生产中的可行性研究[J]．现代中医药，2008，28(2):63－65．

[6]顾利红，朱品业．日光和温度对绿原酸供试液稳定性的影响[J]．中成药，1999，21（11）：568．

[7]程令梅，李桂冬．HPLC法测定珍菊降压片中野菊花绿原酸的含量[J]．化学分析计量，2007，16（1）：48－49．

Simultaneous Content Determination of Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Xiangju Capsules by RP－HPLC

Sun Fei,Sun Xin,Jin Rong
(Jixi Food and Drug Testing Center,Jixi,Heilongjiang,China 158100)

Objective To establish an RP－HPLC method for simultaneous content determination of chlorogenic acid and caffeic acid in Xiangju Capsules．M ethods The Agilent Zobax SB－C18colume(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used;the mobile phase was acetonitrile－methanol－0．2%H3PO4by gradient elution and the detection wavelength was 328 nm;the flow rate was 1．0 mL／min,the injection volume was 20 μL,and the column temperature was 30℃．Results The linear response of chlorogenic acid ranged from 2．034× 10－2－5．085×10－1μg(r＝0．999 9，n＝7),and the linear response of caffeic acid ranged from 2．218×10－2－5．545×10－1μg(r＝0．999 9，n＝7);the average recovery rate of chlorogenic acid was 98．83%(RSD＝0．86%，n＝6),and the average recovery of caffeic acid was 98．72%(RSD＝0．88%，n＝6)．Conclusion The method is convenient,quick and accurate,and can be used for the quality control of Xiangju Capsules．

Xiangju Capsules;content determination;chlorogenic acid;caffeic acid;HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)09－0065－03

孙菲（1981－），女，副主任药师，研究方向为药品检验，（电话）0467－6103277（电子信箱）chenlizhu1980＠163．com。

2016－01－10；

2016－02－19)