基于2D-DIGE技术对早期糖尿病肾病肾阴虚证型患者血浆蛋白质组学研究*

卢洪梅，邹立华，汤水福，胡坤华

(1.广东医学院第二临床医学院中医学教研室，广东东莞 523808;2.深圳市龙岗区人民医院，广东深圳 518172;3.广州中医药大学第一附属医院肾内科，广州 510405; 4.中山大学蛋白质组学转化医学广东普通高校重点实验室，广州 510000)

基于2D-DIGE技术对早期糖尿病肾病肾阴虚证型
患者血浆蛋白质组学研究*

卢洪梅1，邹立华2△，汤水福3，胡坤华4

(1.广东医学院第二临床医学院中医学教研室，广东东莞 523808;2.深圳市龙岗区人民医院，广东深圳 518172;3.广州中医药大学第一附属医院肾内科，广州 510405; 4.中山大学蛋白质组学转化医学广东普通高校重点实验室，广州 510000)

目的:寻找糖尿病肾病肾阴虚证敏感的血浆分子标志物。方法:对12例早期糖尿病肾病肾阴虚患者的血浆和12例正常血浆进行荧光差异双向电泳(2D-DIGE)分析，选择表达差异大于1.5倍的蛋白斑点进行质谱分析。结果:成功建立糖尿病肾病肾阴虚证和正常血浆的胶内差异双向凝胶电泳图谱，通过分析共鉴定出11种差异蛋白质，包括结合珠蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白AI等。结论:荧光差异双向电泳能够客观显示糖尿病肾病肾阴虚证与正常血浆之间的蛋白质表达差异，本研究鉴定的11种蛋白有可能为糖尿病肾病的早期诊断和中医证型研究提供潜在的血浆分子标志物。

糖尿病肾病;肾阴虚证;蛋白质组学;荧光差异双向电泳

糖尿病肾病(DN)是指糖尿病进展到合并肾小球硬化阶段，临床以蛋白尿为突出表现。在我国，肾病已成为继心血管、眼科病变之后高发病率的糖尿病并发症［1］。许多研究者利用现代生物学技术，开展了DN中医证型与实验室指标、分子生物学以及遗传学等相关性研究，如证候学研究［2］、证素演变规律［3］、证候诊断模型［4］、证候与实验室指标相关性研究［5］。“证”是对疾病某一阶段病因、病性、病位以及病机本质的概括，具有相对稳定性;人体的蛋白质变化一定程度上可以推断某时段某部位病理生理变化，同样具有相对稳定性。因此，越来越多的证型研究引入了蛋白质组学技术，如慢性乙肝、子宫内膜异位症、原发性肝癌、肺癌证型研究［6-9］、中医证本质［10］等。其目的是试图寻找和证实中医证型的微观物质基础。本研究使用荧光差异双向电泳和质谱分析的方法，初步筛查出DN肾阴虚证和正常人血浆中的差异蛋白质。

1 材料与方法

1.1 纳入标准

研究对象均选自2013年1月至2013年8月广州中医药大学一附院门诊和住院病例，有明确早期糖尿病病史，年龄在18～45岁之间共12例;对照组选自体检中心，体检健康、年龄在18～45岁之间共12例。病例符合:①糖尿病肾病Mogensen分期标准中的III期，即早期糖尿病肾病期。肾小球滤过率(GFR)大致正常;UAE持续20～200μg/min(或30～300 mg/24 h)。病理:基底膜(GBM)增厚和系膜基质增加更明显，已有肾小球结带型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并已开始出现肾小球荒废。②依据中华中医药学会《糖尿病中医防治指南》(2007年版)和《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)糖尿病肾阴虚证候诊断标准。主症腰膝酸软、五心烦热，次症眩晕耳鸣或耳聋、口燥咽干、潮热盗汗，或骨蒸发热、形体消瘦、失眠健忘、齿松发脱、遗精、早泄、经少、经闭、舌质红少津，少苔或无苔、脉细数，具备主症和至少2项次症即可确诊。

1.2 蛋白质组学研究方法

1.2.1 实验器材 仪器设备:DeCyder V6.0分析软件(Amersham Biosciences)、DU730型核酸/蛋白分析仪(Beckman)、UltraflexIII质谱仪(Bruker Daltonics)、IPGphor III等电聚焦仪、Ettan DALT six大型垂直电泳系统、Typhoon9400多功能激光扫描成像系统。试剂盒:除高丰度蛋白试剂盒(Sigma)、蛋白质纯化试剂盒、2-D Quant Kit蛋白质定量试剂盒、IPG strip4-7，24 cm和IPG buffer(pH4-7)固相pH值干胶条、CyDye DIGE Flour(minimal Dye) Labelling Kit荧光标记试剂盒(GE healthcare)。

1.2.2 样本制备 静脉采血5 ml，置于肝素抗凝管，离心20 min(2000 r/min)，取离心后上清液存放于－80℃冰箱。标本收齐后分别取血浆80 μL，使用除高丰度蛋白试剂盒除去多数高丰度白蛋白及IgG，然后使用Clean-up Kit蛋白质纯化试剂盒纯化血浆蛋白，完成后给予2-D Quant Kit定量试剂盒进行血浆蛋白定量测定。

1.2.3 荧光双向电泳 ①荧光标记。CyDye DIGE Flour(minimal Dye)Labelling Kit荧光标记试剂盒含有cy2、cy3和cy5共3种荧光，其中cy2用于标记内参，内参是指所有样本等量混合后均分至各张胶的样本量。每50 μg血浆蛋白用 Dye染料400pmol进行标记，之后使用赖氨酸终止反应，将cy2、cy3、cy5标记样本依据实验方案置于同一管内。②第一向电泳。将已经标记的血浆蛋白样品均匀加至IPGphor III等电聚焦仪胶条槽，然后放入 IPG strip4-7，24 cm固相pH值干胶条，设置等点聚焦(IEF)参数:30 V、6 h、step;60 V、6 h、Gradient;200 V、1 h、Gradient;500 V、2 h、Gradient;1000 V、2 h、Gradient;3500 V、2.5 h、Gradient;10000 V、2.5 h、Gradient;10000 V、8 h、step至总电压伏小时数达80000 Vhr。IEF结束后，用含有10 mg/mL二硫苏糖醇和25 mg/mL碘乙酰胺平衡缓冲液将IPG胶条分别平衡15 min。③第二向电泳。使用12.5% 的SDS-PAGE胶，先设置电泳参数2 W/胶，50 min后从胶条中提取蛋白，再用17W/胶的恒功率，当凝胶底部边缘显示溴酚蓝指示剂即为完成。

1.2.4 胶内差异图像采集 胶内差异图像采集由Typhoon9400多功能激光扫描成像系统完成。选择激光波长 cy2488nm、cy3532nm和 cy5633nm。然后用DeCyder V6.0分析软件对图像进行差异分析，凝胶图像经探点、分组、匹配分析后，计算Average ratio寻找差异蛋白，统计分析使用Student T-test法。选择表达差异＞1.5倍且T-test P＜0.05的血浆蛋白斑点为差异蛋白质。

1.2.5 质谱分析 首先切取蛋白质斑点(把染色凝胶放进Spot handling workstation)，然后用胰酶(12.5 mg/mL)将切取的蛋白质酶解成肽段，再通过UltraflexIII质谱仪获取肽质量指纹图谱(PMF)及4个肽段的MS/MS图谱。最后进行蛋白质斑点图谱鉴定，以MASCOT(Matrix Science)为搜索引擎，使用Biotools检索软件。搜索参数:NCBInr数据库、human检索种属、combined数据检索方式、允许最大漏切位点为1、胰蛋白酶。最终得分＞66分(质量误差PMF 75ppm、MS/MS 0.5Da)为差异蛋白质。

2 结果

2.1 胶内差异图像

通过使用荧光差异双向电泳技术，本研究准确获得了早期糖尿病肾病肾阴虚证血浆蛋白表达图谱。该图谱由红绿蓝3个图谱融合而成，绿色图谱为糖尿病肾病血浆蛋白，红色图谱为正常血浆蛋白，蓝色图谱为内参。

2.2 图像分析

图1 斑点1102在糖尿病肾病肾阴虚证和正常血浆中的表达

图1 显示，通过DeCyder 6.0软件检测，每块荧光差异双向凝胶电泳胶图上约有1600个蛋白质斑点。最终鉴定出病例组和对照组中血浆蛋白质差异斑点(＞1.5倍且P＜0.05)有11个，病例组中6个斑点表达上升，5个斑点表达下调。斑点图中斑点的位置和3-D图对差异斑点的差异情况有清晰的展示，如斑点1102。

表1 差异斑点质谱鉴定结果

2.3 质谱结果

表1显示，使用MALDI-TOF/TOF-MS分析，获得11个差异蛋白质斑点的肽质量指纹图。通过检索NCBInr数据库(human)获取各差异蛋白质斑点名称。

3 讨论

DN属于中医“消渴病”范畴，其基本病机为阴虚燥热，病位主要在肺、脾(胃)、肾，其中以肾尤为关键。DN是糖尿病发展到肾脏并发症阶段，即消渴日久、脏腑虚弱、正气不足，故而出现多种变证;根据阴阳互根互用，消渴病久可致阴阳虚损，包括肾阳虚证和肾阴虚证。肾阴虚症见腰膝酸软、五心烦热、眩晕耳鸣、口苦咽干、潮热盗汗、多梦、舌红少苔、脉细。五脏中肾主藏精。《素问·金匮真言论》:“夫精者生之本也。”肾阴虚证的物质基础是肾精虚损。肾阴虚证是疾病过程中特定阶段病因病机，即使在不同的疾病，也一定有相同的物质基础。而“证”代表的是身体机能的即刻状态，一定会受到疾病的影响，DN与其他疾病之间存在差异，因此其肾阴虚证之间也有差异。

应用蛋白质组学进行证型研究包括对阴虚证型的相关研究，如甲亢、慢性心衰、脑梗塞、痴呆、红斑狼疮阴虚证［11-16］。本研究对8例早期DN肾阴虚证和8例正常血浆进行蛋白组学研究，共发现差异表达蛋白11个，分别是尿苷酸合成酶亚型J、巨球蛋白、人血清白蛋白、补体C3、人免疫球蛋白、载脂蛋白AI、HP蛋白质、CD5抗原、原肌球蛋白-3、凝溶胶同工酶GT-B、人绒毛膜促性腺激素。

2D-DIGE技术灵敏度高，误差低，重复性强。比较传统的双向凝胶电泳技术(考染、银染)，优势在于引进内参cy2校正组间差异;提高对低丰度蛋白的检测灵敏度;改进1样本/每胶为3样本/每胶，去除胶间人为差异［17］。相较于高通量的蛋白质组学研究技术，如Luminex xMAP技术(液态芯片)，虽然该技术同样采用荧光染色、内参等技术方法，且具有高通量特性(1次检测100个指标)，但2D-DIGE技术可以从源头寻找蛋白质，原始创新;而高通量的芯片技术一般是基于已知蛋白［18］。

HP蛋白质是一种肝脏合成的糖蛋白［19］，其表达异常是血管内膜损伤［20］和微循环障碍的危险因素。而消渴病阴液亏虚，虚火燔灼浓缩津液，血中津液不足，导致瘀血阻滞脉络。故DN肾阴虚证与HP蛋白质高表达导致微循环障碍具有关联性。

凝溶胶蛋白(gelsolin，GSN)是一种调节细胞结构和代谢的蛋白质［21］，在肾脏疾病中具有重要的作用。凝溶胶蛋白高表达促使细胞凋亡［22］，表现为高代谢状态，与肾阴虚五心烦热、口苦咽干、潮热盗汗、舌红等症状相符。故DN肾阴虚证与凝溶胶蛋白高表达促进细胞凋亡具有关联性。

载脂蛋白AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分［23］，能降低胆固醇［24］和低密度脂蛋白［25］。血脂紊乱是DM患者肾脏微循环障碍的重要危险因素。Overgaard等［26］证实，载脂蛋白A1在DN患者中呈低表达，并推断其为DN早期诊断标记物，与本实验结果相符。中医认为载脂蛋白A1属于精微物质，当其在体内减少，是阴精逐渐亏虚，最终导致肾阴亏虚。因此，我们推测载脂蛋白A1可能是DN肾阴虚证型生物学标志物。

C3补体、人免疫球蛋白是与免疫相关蛋白质，其过度表达会导致糖尿病患者肾组织自损［27］。中医认为，人免疫力的强弱与先天禀赋相关，而肾中阴精源于先天。先天禀赋不足，累及肾阴，机体呈肾阴虚体质，加之后天失养则致肾阴虚证。故DN肾阴虚证与补体C3b受体、人免疫球蛋白高表达导致免疫缺陷具有关联性。

人绒毛膜促性腺激素(HCG)通过结合甲状腺细胞TSH受体，能够刺激甲状腺活性。因此我们推断，肾阴虚证诸如口干舌燥、心烦失眠、体质量下降等症状与甲状腺作用失调相关。孙晓敏［28］证实，在不同肾病肾阴虚证中HCG均呈高表达状态，与本实验结果一致。

本实验通过分子水平的研究，获取了DN诊断和标记物信息，促进DN肾阴虚证的本质研究，有助于总结出肾阴虚证的一般规律。

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Research on Plasma Proteomics of Kidney Yin Deficiency of Early Diabetic Nephropathy Patients Plasma Proteomic Analysis Based on 2D-DIGE Technology

LU Hong-mei1，ZOU Li-hua2△，TANG Shui-fu3，HU Kun-hua4
(1.Department of TCM，the Second Clinical Medical School，Guangdong Medical College，Guangdong Dongguan 523808，China;2.Longgang People’s Hospital of Shenzhen，Guangdong Shenzhen 518172，China;3.Internal Medicine Dept.of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 4.Key Laboratory of Proteomics Translational Medicine of Guangdong Higher Education Institutes，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510000，China)

Objective:To investigate the sensitive blood plasma molecular markers in kidney yin deficiency of diabetic nephropathy(DN).Methods:Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis(2D-DIGE)was used to analyse the plasma which was from the patients with kidney yin deficiency of early diabetic nephropathy and the normal person from 24 patients.Proteins that showed differential expression of a 1.5-fold change were analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.Results:Two-dimensional electrophoresis(2-DE)maps of plasma proteins in patients with kidney yin deficiency of diabetic nephropathy(DN)and healthy adults were established successfully.We validated 11 differentially expressed proteins detected by 2D，including HP protein、gelsolin、apolipoprotein A-I，etc.Conclusion:Proteomic analysis can objectively reveal the differences of protein expression between the two kinds of blood plasma.The 11 proteins that we have found have potential to provide plasma molecular markers for the clinical diagnosis and research on TCM pattern of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy;Kidney yin deficiency;Proteomics;2D-DIGE

R587.1

B

1006-3250(2016)06-0812-04

2015-12-08

广东医学院科研基金博士学位人员科研启动项目(B2013008)-早期糖尿病肾病肾阳虚证型的血浆蛋白质组学分析

卢洪梅(1983-)，女，重庆人，医师，医学博士，从事中医肾病的临床与研究。

△通讯作者:邹立华，Tel:13510089946，E-mail:zjgzzlh@126.com。