左金方和5-FU对胃癌细胞生长及BAX/Bcl-2表达的调控研究*

周红祖，周禹练，余惠旻△

(1.深圳市中医院，广东深圳 518020;2.深圳大学医学院，广东深圳 518060)

左金方和5-FU对胃癌细胞生长及BAX/Bcl-2表达的调控研究*

周红祖1，周禹练2，余惠旻2△

(1.深圳市中医院，广东深圳 518020;2.深圳大学医学院，广东深圳 518060)

目的:研究左金方和5-FU单独与联合对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的影响及对BAX/Bcl-2蛋白表达水平的改变。方法:将不同浓度的左金方、5-FU及两药联合作用于体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803，Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖率的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot法检测bcl-2、bax蛋白表达。结果:1.00 ug·mL－1左金方、50.00、100.00 ug·mL－15-FU作用GES-1细胞24 h后，细胞存活率分别为(107.54± 2.25)%、(53.67±1.91)%和(47.43±1.35)%，作用MGC803细胞24 h后，细胞凋亡率分别为(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)%;左金方联合5-FU(1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00+100.00)作用GES-1细胞24 h后，细胞存活率分别为(81.66±2.22)%和(78.68±2.10)%，作用MGC803细胞24 h后，相应的凋亡率为(61.30±1.71)%和(71.30±1.79)%，与单独用药比较差异有统计学意义。Western Blot凝胶电泳图可以看出，左金方联合5-FU(1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00 +100.00)作用MGC803细胞24 h后，进一步促进Bax的表达，降低Bcl-2的表达，与各单独用药组比较差异有统计学意义。结论:左金方与5-FU联合用药有大幅降低5-FU细胞毒性作用，显著提高人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的存活率;通过促进MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2的低表达，促进人胃癌细胞的凋亡。

左金方;5-FU;GES-1;MGC803;联合用药;凋亡

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一［1-2］，目前尚无广泛治疗作用的抗胃癌中药制剂问世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，目前临床常用于急慢性胃炎和消化性溃疡的治疗［3］。近年来，研究还发现它具有抗肿瘤作用［4-5］。我们前期研究发现，左金方能诱导体外培养胃腺癌细胞的凋亡，显著抑制了胃癌裸小鼠移植瘤的生长［6-8］。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种临床治疗胃癌常用的化疗药物，但因生物利用度低，对肿瘤细胞选择性小、毒副作用大、治疗剂量与中毒剂量接近等缺点，限制了其临床应用。本研究在前期研究的基础上，采用体外培养人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞株MCG803的方法，探讨左金方和5-FU单独及联合用药对胃癌细胞增殖的抑制作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2培养箱(美国Shella公司);DC300型倒置荧光相差显微镜(德国Leica公司);超净工作台(比利时Esco公司);Rotofix32型离心机(德国Hettich公司);AllegraTM21R型低温离心机(美国Coulter公司);Epics XL型流式细胞仪(美国 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶标仪(德国BMG公司)。

1.2 主要药物与试剂

黄连、吴茱萸均购自深圳华辉药业有限公司，由深圳市中医院中药科刘志诚主任药师鉴定，分别为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎和芸香科植物吴茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果实。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化学研究所Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均购自美国 Sigma公司; DMEM培养基、胰酶(trypsin，美国Gibico公司);胎牛血清(FBS，美国 Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司)，5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批号 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美 国Lifetechnology公司)。

1.3 细胞

人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1和人低分化胃腺癌细胞系MGC803购自中山大学医学院动物细胞中心(细胞源自美国ATCC细胞库)。

2 方法

2.1 药物制备

左金方传统汤剂冻干粉由本实验室提供，取黄连30 g、吴茱萸5 g加8倍蒸馏水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min过滤，合并3次滤液，冷冻干燥，每克干粉含生药3.98 g。经HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85%，巴马汀9.19%，药根碱4.86%，吴茱萸碱0.17%，吴茱萸次碱0.19%。将左金方冻干粉溶于去离子水中配置成1 mg/mL的母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。

5-FU的配制方法:取适量5-氟尿嘧啶注射液原液加细胞培养液配制成1 mg/ml母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。

2.2 细胞培养

GES-1人正常胃黏膜上皮细胞株、MGC803人胃腺癌细胞株在10%小牛血清DMEM培养液中，于37℃条件下，在湿度为100%、含CO2为5%(体积分数)的CO2培养箱中常规培养。

2.3 观察指标与方法

2.3.1 CCK-8检测细胞活性 取人正常胃黏膜上皮细胞GES-1对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液(5×104/mL)加入96孔板、100 μL/孔，培养12 h后给药，实验组分别加入不同浓度的供试药物，分别培养24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD)。其中将未经处理的对照组细胞存活率设定为100%。细胞抑制率=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)× 100%。

2.3.2 流式细胞仪检测 调整人胃腺癌细胞MGC803密度为2×105/mL，以1.5 mL/well种入6孔板，每组6个复孔。药物作用24 h后，细胞刷刮取细胞，800 r/min离心5 min去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液500 uL，再加入荧光染料(10 uL Annexin V FITC和5uL PI混合液)，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，室温避光染色15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率(激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI)。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。

2.3.3 Western blot检测Bcl-2和Bax的表达

提取蛋白前将PMSF 10 μL加入1 mL细胞裂解液RIPA，取经药物作用后细胞约2.4×106个加入RIPA，冰上裂解30 min，10000 r/min离心10 min取上清。BCA测定蛋白浓度，酶标仪测定波长为A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。灌制12%分离胶，4%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶。吸取80 μg总蛋白，恒压100 V电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部。湿法电转恒压100 V、120 min，将蛋白从SDSPAGE凝胶转至PVDF膜。3%的脱脂奶粉/PBS-T封闭，按1∶500稀释Rabbit anti-Bcl-2/-Bax，4℃孵育过夜。1∶3000稀释二抗Goat anti-Rabbit IgG，孵育1 h，增强化学法(Enhanced Chemiluminescence，ECL)显影，UVI凝胶成像系统摄像。

2.3.4 统计学方法 采用 SPSS 1010统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差 (±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 药物对GES-1细胞存活率的影响

3.1.1 左金方对GES-1细胞存活率的影响CCK-8实验结果显示，左金方对GES-1细胞活力的影响很小，即当给药浓度增加到一定程度后(如10 ug·mL－1)，随着给药浓度的增加、作用时间的延长，细胞活力稍有减弱。图1显示，小剂量的左金方能促进人正常胃黏膜上皮细胞的增殖和分裂，1.00 ug ·mL－1左金方作用GES-1细胞24、48 h的细胞存活率分别为(107.54±2.25)%和(115.96±2.86)%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

3.1.2 5-FU对GES-1细胞存活率的影响CCK-8实验结果显示，对照组细胞生长良好，5-FU对GES-1细胞活力的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力逐渐减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。图2显示，小剂量的5-FU会对人正常胃黏膜细胞产生毒性作用，随着用药浓度增加其毒性亦增强。

图1 不同浓度的左金方作用不同时间对GES-1细胞存活率的影响

图2 不同浓度5-FU作用不同时间对GES-1细胞存活率的影响

3.2 药物对MGC803细胞凋亡的影响

表1显示，不同浓度左金方、5-FU作用于MGC803细胞24 h，肿瘤细胞中后期凋亡率随给药浓度的逐渐增高，给药时间的延长而逐渐增大，以中后期细胞凋亡更为明显，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

3.3 联合用药对GES-1和MGC803细胞生长的影响

3.3.1 联合用药对GES-1细胞存活率的影响 表2显示，根据左金方与5-FU单独用药影响，GES-1和MGC803细胞生长的实验结果，选定1.00 ug·mL－1为左金方，50.00、100.00 ug·mL－1为5-FU联合用药的浓度。联合用药的CCK-8结果显示，1.00 ug·mL－1左金方与50.00、100.00 ug·mL－15-FU联合用药，可大幅度降低5-FU对细胞的毒性，提高人正常胃黏膜细胞的存活率，联合用药的效果与5-FU单独用药组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3.3.2 联合用药对MGC803细胞凋亡的影响 图3、4显示，从流式细胞的检测结果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分别与50.00 ug·mL－1、100.00 ug·mL－15-FU联合用药作用于MGC803细胞24 h后，细胞凋亡率大幅度提高(中后期凋亡占主导)，联合用药组与左金方和5-FU单独用药比较差异有统计学意义(P＜0.05)，即联合用药组诱导凋亡的作用优于各单独用药组。

表1 不同浓度药物作用24 h对MGC803细胞凋亡率的影响(n=6)

表2 左金方与5-FU联合用药作用不同时间对GES-1细胞存活率的影响

3.4 左金方和5-FU单独与联合对人胃癌MGC803细胞BAX/Bcl-2蛋白表达的影响

Western Blot凝胶电泳图显示，1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU分别作用于MGC803细胞24 h后，Bax的表达增加，而Bcl-2的表达减少;左金方联合5-FU(1.00+ 50.00)、左金方联合5-FU(1.00+100.00)用药24 h后，Bax的表达进一步增加，而Bcl-2的表达进一步减少，与各单独用药组比较差异有统计学意义(P＜0.05);图5显示，左金方和50.00 ug·mL－15-FU对人胃癌MGC803细胞BAX/Bcl-2蛋白表达的影响。

4 讨论

胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时病变已属晚期，所以胃癌切除术后化疗已成为晚期胃癌的主要治疗方法［9］。常用的化疗药物有丝裂霉素(MMC)、顺铂(DDP)、氟脲嘧啶(5-FU)、足叶乙甙(VP-16)、阿霉素(ADM)、优福定(UFT)等。化疗药物在胃癌的治疗中有一定的效果，但其具有严重的毒副作用，会产生明显的消化道反应、骨髓抑制、身体虚弱、发热、脱发、肾毒性、神经毒性和过敏反应等并发症［10］。大量研究证实，中药配合化疗治疗胃癌可明显改变症状、增加有效率、延长生存期，防复发、抗转移，平衡和调节机体内环境，提高和改善机体免疫能力，保护重要器官功能，减轻化疗毒副反应，提高生存质量［11］。

图3 各组Annexinⅴ/PI凋亡检测图

图4 各组肿瘤细胞凋亡率

图5 左金方和5-FU对人胃癌MGC803细胞BAX/Bcl-2蛋白表达的影响

本研究CCK-8结果显示，左金方对人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1活力影响很小，而小剂量的5-FU具有很明显的细胞毒性。左金方与5-FU联合用药后，显著提高人正常胃黏膜细胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的细胞毒性。流式细胞仪结果显示，左金方与5-FU均能诱导胃癌细胞MGC803的凋亡，二者联合用药后，诱导胃癌细胞MGC803凋亡的作用优于左金方或5-FU单独用药。

细胞凋亡是目前肿瘤研究中的热点之一，目前普遍认为凋亡与细胞分裂、细胞分化类似，受细胞内多种基因调控，是一个级联式(cascade)基因表达的结果，bcl-2和bax的比率就成为细胞是否发生凋亡的关键因素［12］和评价药物抗肿瘤的重要指标。大量的研究表明，抑制肿瘤细胞的凋亡是中药治疗肿瘤的重要机制。本研究中Western Blot凝胶电泳中Bax与Bcl-2蛋白表达的结果表明，左金方与5-FU联合用药，促进了MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2的低表达，其作用优于单独用药。结合CCK-8和流式细胞仪的检测结果说明，左金方与5-FU联合用药显著提高人正常胃黏膜细胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的细胞毒性作用，并通过促进MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2的低表达，促进胃腺癌细胞的凋亡。

临床上依据肿瘤的组织分化(高分化、中分化和低分化)来判断其恶性程度，高分化肿瘤恶性程度低、预后较好，低分化肿瘤恶性程度高、预后较差，中分化肿瘤介于二者之间。MGC-803细胞株属于低分化胃腺癌细胞系，结合前期左金方诱导人胃腺癌细胞株SGC-7901(中分化)的研究［6-8］，本研究不仅为左金方诱导胃癌细胞的凋亡作用增添了新的实验依据，也为拓展可用于临床治疗胃癌的中药及其复方制剂、降低抗胃癌化疗药物的毒副作用、提高治疗效果提供了新的思路。

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Regulation of Growth and BAX/Bcl-2 Expression of Human Gastric Cancer Cells by Zuojin Decoction and 5-FU

ZHOU Hong-zu1，ZHOU Yu-lian2，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Guangdong Shenzhen 518020，China; 2.School of Medicine，Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518060，China)

Objective:to study the cell growth of Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1，the apoptosis of Human Gastric Carcinoma MGC803 and the changes of Bax/Bcl-2 in the level of protein expression caused by ZuoJinFang and 5-Fu separately and together.Methods:Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1 and Human Gastric Carcinoma MGC803 cells were cultured in vitro and treated by ZuoJinFang and 5-Fu with different concentration separately and together，the growth inhibitions of GES-1 cell were analyzed by Cell Counting Kit-8(CCK-8)，the apoptosis rates of MGC803 cell were studied by flow cytometry and the expressions of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.Results:After the cells treated by 1.00 ug·mL－1ZuoJinFang，50.00、100.00 ug·mL－15-FU for 24 h separately，the percentage of GES-1 cell viabilities were(107.54±2.25)%，(53.67±1.91)and(47.43±1.35)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)and(45.60±1.14)%;after the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the percentage of GES-1 cell viabilities were(81.66±2.22)%and(78.68±2.10)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(61.30± 1.71)and(71.30±1.79)%，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.The Western Blot gel electrophoresis figures show that the expressions of Bax were further increased and the expressions of Bcl-2 were decreased accordingly after the MGC803 cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00 +50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the GES-1 cells，promoted the apoptosis of gastric carcinoma MGC803 cells by promoting high expression of Bax protein and low expression of Bcl-2 protein.

ZuoJinFang;5-FU;GES-1;MGC803;Drug conbibation;Apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0777-04

2015-10-12

广东省中医药局项目(20141253)

周红祖(1971-)，女，新疆人，副主任药师，从事中药肿瘤药理学及中药学基础研究。

△通讯作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，医学博士，从事中药及其复方抗肿瘤的临床与研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。