三价铁对灯盏花素与溶菌酶相互作用的影响

郑茂东，颜娟，王爱萍，赵秀花，张鹤鸣

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口 075000)



三价铁对灯盏花素与溶菌酶相互作用的影响

郑茂东，颜娟，王爱萍，赵秀花，张鹤鸣

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口 075000)

摘要：目的探讨三价铁(Fe3+)在模拟人体正常生理环境下对溶菌酶与灯盏花素相互作用的影响。方法运用同步荧光光谱法观察有无Fe3+参与时灯盏花素与溶菌酶的相互作用。结果有、无Fe3+存在，灯盏花素与溶菌酶均可形成基态复合物从而猝灭溶菌酶的内源性荧光，猝灭原因均为静态猝灭。有、无Fe3+存在，热力学温度为308 K时灯盏花素与溶菌酶的结合常数分别为1.15×106、1.08×106L/mol，结合位点数分别为0.993、1.19。在Fe3+存在时，灯盏花素与溶菌酶作用力由疏水作用改变为范德华力和氢键，结合位点靠近色氨酸，并使色氨酸的疏水性增强。结论Fe3+不改变灯盏花素与溶菌酶的猝灭作用机制，但使得两者结合常数、结合位点数和作用力类型发生改变。

关键词：Fe3+；灯盏花素；溶菌酶；荧光光谱法；同步荧光法

溶菌酶是小分子碱性蛋白，普遍存在生物机体内，能与大量外源性和内源性物质结合。研究溶菌酶有利于从微观水平上探讨药物在生物体内的药理作用、代谢转化过程和不良反应，为临床合理用药提供参考[1~4]。灯盏花素是从中药灯盏花中提取的黄酮类成分，其主要有效成分为灯盏乙素，是一种黄酮苷类化合物，具有扩张脑血管、增加脑血流量等作用[5]。铁在生命体系中是常见的微量金属元素，其参与的生物过程包括NDA合成、呼吸作用、能量转换、氧的运输等。2014年6月～2015年1月，我们观察人体内微量金属元素铁(Fe3+)对灯盏花素与溶菌酶作用的影响，进而了解灯盏花素在人体内的吸收、分布、代谢以及其药理作用机制。

1材料与方法

1.1仪器和试剂 荧光分光光度计(美国 Varian 公司，附带Peltier 电子恒温装置)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；可调节加样器(芬兰 Biohit 公司)；pHS-3C 型精密 pH 计(上海雷磁仪器厂)；溶菌酶(美国sigma 公司，用缓冲溶液配制浓度为1.06×10-4mol/L)；灯盏花素(昆明龙津药业股份有限公司，批号：20140512-1，用缓冲溶液配制浓度为1.10×10-4mol/L)；Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(浓度为0.02 mol/L，pH 7.40，内含0.15 mol/L的NaCl)；FeCl3为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

2结果

2.1灯盏花素、灯盏花素-Fe3+与溶菌酶相互作用随着灯盏花素浓度的增加，溶菌酶的荧光强度逐渐降低，同时最大发射波长蓝移3~5 nm。加入Fe3+前后溶菌酶的峰形和峰位没有发生明显变化，但是猝灭程度明显增大。见图1。表明灯盏花素与溶菌酶发生结合作用，Fe3+对其相互作用有一定影响。

注：A 灯盏花素与溶菌酶相互作用　　B灯盏花素-Fe3+与溶菌酶相互作用

2.2灯盏花素、灯盏花素-Fe3+与溶菌酶作用相关参数变化KSV随着温度的升高而减小，KLB随着温度的升高而增大，说明灯盏花素对溶菌酶的猝灭过程是由于两者形成不发光的复合物而引起的静态猝灭。Fe3+存在时，灯盏花素对溶菌酶的猝灭程度有所增加，但猝灭类型未发生改变，仍为静态猝灭。Fe3+存在时，灯盏花素与溶菌酶的结合常数K增大，表明Fe3+参与加强了灯盏花素与溶菌酶的作用，但是结合位点数近似等于1。热力学参数△rHm>0，△rSm>0，可判定灯盏花素与溶菌酶作用力为典型的疏水作用。Fe3+存在下，△rHm<0，△rSm<0，推测灯盏花素与溶菌酶的作用力类型改变以氢键和范德华力为主。见表1。

2.3灯盏花素、灯盏花素-Fe3+对溶菌酶构象的影响溶菌酶中色氨酸和酪氨酸残基的荧光强度均有规律减弱，色氨酸残基的荧光强度降低更加明显，说明溶菌酶的荧光主要是色氨酸残基，推测灯盏花素与溶菌酶的结合位点更接近于色氨酸残基。色氨酸的最大发射波长发生蓝移，表明灯盏花素的加入使色氨酸残基附近的极性减弱，疏水环境增强，肽链的伸展程度减小[12]。Fe3+存在下，酪氨酸和色氨酸残基的荧光猝灭程度增加，峰形和峰位发生改变，说明Fe3+参与了灯盏花素与溶菌酶的作用过程，但未改变色氨酸残基附近的环境。

表1　灯盏花素、灯盏花素-Fe3+与溶菌酶作用的相关参数

3讨论

溶菌酶又称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，研究蛋白的空间构象、酶动力学、分子进化与分子免疫间的关系时，溶菌酶作为模型体系可提供载体。另外，溶菌酶也是血浆中重要选择性载体蛋白，能够与许多内、外源性物质结合，进而发挥其生物功能。同时，溶菌酶是临床应用的有效抗菌消炎剂，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌有抑杀作用，具有抗病毒作用，参与机体多种免疫反应。人体溶菌酶的浓度可用于诊断多种疾病，如再生障碍性贫血和急性白血症的诊断指标之一是血清溶菌酶的水平低于正常值。通过测定尿液和体内的溶菌酶水平，可以判断肾小管功能障碍性疾病和烧伤患者的病情严重程度。溶菌酶作为一种天然蛋白质，在医学方面应用前景广阔[1~4]。

大量研究显示，灯盏花素具有扩张脑血管、增加脑血流量等作用，深入研究灯盏花素在体内的药效、不良反应及作用机制有重要的临床意义。探讨灯盏花素与溶菌酶的相互作用，有利于从分子水平上阐明灯盏花素在体内的作用机制，了解灯盏花素发挥药效的作用机理，也是当前生命科学、医学领域的研究热点。另外，人体是一个复杂的体系，人体内存在多种金属离子，能与药物或酶蛋白结合发挥独特作用。本文利用同步荧光光谱法模拟正常人体生理环境下Fe3+对溶菌酶、灯盏花素的相互作用及影响，将灯盏花素-溶菌酶二元体系拓展至灯盏花素-金属离子-溶菌酶三元体系加以研究，得到更加丰富的理论数据。表明Fe3+虽然不改变灯盏花素与溶菌酶的猝灭作用机制，但使得两者结合常数、结合位点数和作用力类型发生改变。Fe3+存在时，灯盏花素与溶菌酶的结合常数增大，表明Fe3+参与并加强了灯盏花素与溶菌酶的作用。从药学和临床医学两个角度考虑，由于Fe3+的存在，灯盏花素在血浆中释放更缓慢，贮留时间延长，有利于延长灯盏花素在体内的作用时间，使其药效更持久。说明复杂的生命体系中金属离子对物质的代谢、转运有独特作用。

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(收稿日期：2015-10-09)

中图分类号：R969

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)05-0079-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.033

基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目(ZD20140167)；张家口市科技局科技计划项目(1421132D)。