替莫唑胺耐药细胞系SHG-44/TR生物学特征及其耐药机制

丁凤霞，朱仲玲，阎昭

(天津医科大学肿瘤医院·国家肿瘤临床医学研究中心·天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060)



替莫唑胺耐药细胞系SHG-44/TR生物学特征及其耐药机制

丁凤霞，朱仲玲，阎昭

(天津医科大学肿瘤医院·国家肿瘤临床医学研究中心·天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060)

摘要：目的探讨对替莫唑胺耐药的人胶质瘤细胞系SHG-44/TR的生物学特征及耐药机制。方法通过体外分阶段剂量递增诱导法使人脑胶质瘤细胞系SHG-44对替莫唑胺产生耐药性，建立耐药细胞系SHG-44/TR。采用细胞集落形成试验和噻唑蓝比色法检测SHG-44/TR增殖情况、耐药性及耐药指数；采用 Western -blotting法检测耐药蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)及人类错配修复蛋白2(hMSH2)表达变化；流式细胞仪检测SHG-44/TR细胞周期变化。结果历时8个月成功建立了对替莫唑胺耐药的人胶质瘤细胞 SHG-44 /TR。与SHG-44比较，SHG-44/TR对替莫唑胺的耐受程度差异有统计学意义(P<0.05)；SHG-44/TR没有细胞周期阻滞现象；SHG-44/TR较亲本细胞MGMT蛋白表达无变化，hMSH2表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论耐替莫唑胺胶质瘤细胞系SHG-44/TR hMSH2表达降低,其耐药机制可能为DNA错配修复缺失。

关键词：替莫唑胺；耐药机制；脑胶质瘤；错配修复；O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶

多形性胶质母细胞瘤是恶性程度较高且最为常见的脑肿瘤[1]。临床上以手术治疗为主、替莫唑胺化疗联合放疗为辅的治疗方案在延长胶质瘤患者生存期方面起了很大作用[2，3]。但是，胶质瘤患者预后仍然不理想，继发性耐药的出现是临床替莫唑胺化疗失败的主要原因；耐药机制包括O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶 ( MGMT)的过表达和DNA错配修复(MMR)的缺失以及碱基切除修复等[4]。2014年4～12月，本文采用替莫唑胺为诱导剂，通过浓度梯度递增诱导法建立对替莫唑胺耐药的脑胶质瘤细胞系，并探讨其在MMR方面的耐药机制。

1材料与方法

1.1材料人恶性脑胶质瘤细胞株SHG-44、替莫唑胺由天津天士力有限公司提供；改良型培养基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibico公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、青霉素、链霉素均购自Sigma公司；兔抗人单克隆抗体MGMT、兔抗人单克隆抗体MSH2、鼠抗人单克隆抗体β-actin抗体均购自CST公司；抗体工作浓度均为1∶ 1 000；SDS裂解液购自碧云天生物技术公司。另有CO2培养箱、流式细胞仪、酶标仪、荧光倒置显微镜等。

1.2细胞培养及耐药细胞系SHG-44/TR的建立SHG-44细胞置于体积分数为10% 胎牛血清、青霉素100 IU/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数为5% CO2和一定湿度的条件下孵育培养，每2 d更换培养液1次，当细胞增殖至80%时用0.25%的胰蛋白酶消化传代。将处于对数生长区的SHG-44细胞制成1×105/mL细胞悬液，培养24 h后加入初始诱导浓度的替莫唑胺(1 μmol/L)[5]，继续培养15 d，然后将药物浓度倍增。当替莫唑胺倍增至16 μmol/L时，每次将浓度提高16 μmol/L至终浓度200 μmol/L，每个浓度都稳定培养15 d，历时8个月建成SHG-44耐药细胞系，命名为SHG-44/TR。

1.3细胞形态观察及MTT法绘制生长曲线将SHG-44和SHG-44/TR分别传代，稳定培养2 d，显微镜下观察细胞形态并用荧光倒置显微镜拍照。取对数生长期的SHG-44和SHG-44/TR细胞消化计数，制成1×104/mL细胞悬液以每孔100 μL铺于96孔板中，每种细胞每个时间段设3个复孔，每24 h在酶标仪490 nm处检测OD值，连续检测7 d。以OD值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。

1.4SHG-44/TR耐药指数检测将处于对数生长期的SHG-44/TR和SHG-44以2×104/mL分别铺于96孔板中，每孔100 μL，每个浓度设5个复孔，过夜培养后加入含替莫唑胺药物培养基100 μL，使终浓度分别为62.5、125、250、500、1 000 μmol/L，并设空白对照组和调零孔。37 ℃ CO2培养箱内继续培养96 h后，每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL的MTT，置于CO2培养箱内，4 h后小心吸出孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使蓝紫色甲瓒结晶溶解，酶标仪检测490 nm处的各孔光吸收值(OD值)。计算SHG-44和SHG-44/TR的半数抑制率(IC50)和耐药指数。

1.5替莫唑胺对SHG-44和SHG-44/TR的抑制情况检测取对数生长期SHG-44、SHG-44/TR细胞，调整细胞密度为4×102/mL，以每孔1 mL接种于12孔板中，贴壁后，各实验组加入含药培养液1 mL(浓度分别为0、25、50、100、200、300、400、500 μmol/L)，每组设2个复孔。每隔3 d换1次液，2周后取出培养板，甲醇固定10 min，加入结晶紫染色液染色30 min。显微镜下观察克隆大小及数量。

1.6细胞周期检测消化收集SHG-44、SHG-44/TR以及加替莫唑胺处理的细胞，室温下1 000 r/min离心5min，预冷PBS重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL 75%预冷冰乙醇，-20 ℃冰箱内固定过夜。第2天将固定好的细胞取出1 000 r/min离心5 min，弃冰乙醇，预冷PBS重悬清洗细胞再1 000 r/min离心5 min。每管加入RnaseA、Triton-X和PI混合液100 μL，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞周期，使用Cellquest软件采集样本，用WinMDI2.9软件行细胞周期分析。

1.7耐药相关蛋白表达情况检测SDS裂解液裂解SHG-44、SHG-44/TR，提取细胞内总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，上样40 μg，15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜封闭1 h，4 ℃孵育MGMT。加入人类错配修复蛋白2(hMSH2)单克隆抗体(一抗)过夜，荧光二抗室温孵育1 h，荧光扫描仪扫描。

2 结果

2.1SHG-44与SHG-44/TR形态学变化SHG-44脑胶质瘤细胞系为成纤维状细胞，梭形并呈现多触角，排列紧密，大小均匀，边界清晰；而替莫唑胺诱导的耐药细胞系SHG-44/TR则形态不规则，触角减少，偶有细胞形态变圆，形态变大，排列松散，大小不均匀。

2.2SHG-44与SHG-44/TR细胞系倍增时间比较耐药细胞系SHG-44/TR比SHG-44生长速度明显减慢。见图1。

图1　SHG-44和SHG-44/TR细胞生长曲线

2.3SHG-44/TR细胞株耐药指数SHG-44细胞系IC50值为(264±23.99)μmol/L， SHG-44/TR细胞IC50值为(1 684±32.17)μmol/L，SHG-44/TR对SHG-44胶质瘤细胞耐药指数[IC50(SHG-44/TR)/IC50(SHG-44) ]约为6，二者对替莫唑胺的耐受程度差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4替莫唑胺对SHG-44、SHG-44/TR细胞克隆形成的抑制作用替莫唑胺对SHG-44/TR细胞克隆形成抑制作用明显低于SHG-44细胞。在替莫唑胺浓度200 μmol/L以上时，SHG-44没有克隆形成，而SHG-44/TR细胞存活率在70%以上，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2　不同替莫唑胺浓度对SHG-44和

2.5SHG-44/TR相对SHG-44细胞周期的变化SHG-44细胞对照组和SHG-44加入100 μmol/L 替莫唑胺组G1期细胞分别为 (50.73±5.74)%和(38.11±4.28)%，G2期细胞分别为(8.28±1.26)%和(20.2±2.11)%，S期细胞分别为(40.99±3.21)%和(41.74±2.79)%；SHG-44细胞加药组相对对照组细胞周期停滞在G2期，且G1期减少，S期基本不变。SHG-44/TR细胞对照组和SHG-44/TR加入100 μmol/L 替莫唑胺组G1期细胞分别为(49.97±5.23)%和(43.73±3.89)%，G2期细胞分别为(14.76±1.54)%和(16.11±1.22)%，S期细胞分别为(35.12±2.98)%和(40.17±3.12)%；两组细胞各个周期变化均不大，细胞周期没有停滞现象出现。

2.6SHG-44/TR耐药相关蛋白表达水平变化SHG-44、SHG-44/TR胶质瘤细胞均不表达MGMT；SHG-44高表达hMSH2，SHG-44/TR细胞内hMSH2表达量较SHG-44明显降低(P<0.05)。

3讨论

作为第二代烷化剂替莫唑胺是治疗胶质瘤的首选药，然而胶质瘤对其耐药却经常发生。本文采用替莫唑胺浓度从低到高的方法经8个月成功诱导成SHG-44耐药胶质瘤细胞系SHG-44/TR。MTT法检测发现SHG-44/TR相对亲本细胞系生长速度明显减慢，耐药指数为6；而且SHG-44/TR细胞形态发生改变，细胞变大，消耗能量增加，增殖能力变慢。对于MGMT高表达的细胞系，降低MGMT表达是克服耐药的主要方法[6]。本文MGMT在SHG-44和SHG-44/TR中都没有表现出高表达[7]，因此SHG-44/TR所产生的耐药性并非MGMT的高表达产生。MGMT低表达或不表达的耐药细胞系中，MMR缺失将代替MGMT高表达产生耐药，于是本研究检测了MMR相关蛋白hMSH2。结果显示，耐药细胞系较亲本细胞hMSH2蛋白明显降低。尽管没有观察MGMT表达变化，但是hMSH2蛋白表达下调使胶质瘤细胞SHG-44产生了耐药性。

MMR是一个修复DNA合成过程中产生的核苷酸碱基错配的系统[8]。当MGMT不存在时，O6-MG可以与胸腺嘧啶配对；在MMR高表达的细胞中O6-MEG-T错配由一个mutS所识别后，新合成链即被切除[9]，其中mutS是一个包含MMR蛋白hMSH2和hMSH6的异二聚体复合物。当另一条链合成时，修复循环再次发生，这些无效插入切除胸腺嘧啶的过程导致细胞周期阻滞和凋亡[10]。因此，敏感细胞系SHG-44加入替莫唑胺 24 h后，细胞周期阻滞在G2期，此时激活DNA修复功能，人类细胞中hMSH2和hMSH6组成的异源二聚体mutS主要识别碱基错误配对和单个无配对甲基环，hMSH2和hMSH3组成的异源二聚体mutS主要识别多个碱基插入或缺失产生的无配对碱基环[11]。mutS蛋白与错配碱基结合，并有MutH和MutL蛋白被募集到附近形成复合物，其中MutH结合在半甲基化GATC序列上，在甲基化碱基的对侧链切割DNA，启动修补合成[12]。如果DNA损伤不能被修复，细胞周期检测点就会启动细胞周期永久停滞机制或者凋亡机制[13]。而如果MMR受损或者缺失将导致MMR无法识别替莫唑胺造成的G-A或者A-C错配，在DNA损伤情况下细胞存活。这将导致DNA复制，并允许细胞周期继续，由此使得细胞对替莫唑胺耐药[14]。因此，SHG-44/TR加入替莫唑胺 24 h后，细胞周期变化较小，没有周期阻滞现象。此外，耐药细胞SHG-44/TR增殖减慢，消耗能量增加，导致了微环境的弱酸性。而胶质瘤细胞微环境的酸化也是引起耐药的一个重要原因，这些酸性物质能被各种离子泵转运到细胞外, 使肿瘤细胞外环境呈酸性, 从而抑制了弱碱性抗肿瘤药物替莫唑胺在肿瘤细胞中的聚集而产生一定的耐药性[15]。

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Biological characteristics and resistance mechanism of temozolomide resistance cell line SHG-44/TR

DINGFengxia,ZHUZhongling,YANZhao

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

Abstract:Objective To investigate the biological characteristics and resistance mechanism of human glioma cell line SHG-44/TR which is resistant to temozolomide (TMZ). MethodsWe induced the human glioma SHG-44 to be resistant to TMZ by dose escalation in vitro, and then established the drug-resistant cell line SHG-44/TR. The colony formation assay and MTT colorimetric assay was used to measure the proliferation, resistance and resistance index of SHG-44/TR cells; Western blotting was used to detect the expression changes of resistance protein O6-methylguanine-DNA methyl transferase (MGMT) and human mismatch repair protein 2 (hMSH2); and flow cytometry was used to detect the SHG-44/TR cell cycle. ResultsAfter eight months, we successfully established TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR. Significant difference was found in the TMZ-resistance between SHG-44 and SHG-44/TR (P<0.05). SHG-44/TR had no cell cycle arrest phenomenon. The expression of MGMT protein did not change in SHG-44/TR cells as compared with that of parent cells, but the expression of hMSH2 was significantly decreased (P<0.05). ConclusionsThe hMSH2 expression of TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR is decreased, and the mechanism may be DNA mismatch repair missing.

Key words:temozolomide; drug-resistance mechanism; glioma; mismatch repair; O6-methylguanine-DNA methyltransferase

(收稿日期：2015-08-14)

中图分类号：R739.41

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0019-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.007

通信作者简介：阎昭(1973-)，男，主任药师，研究方向为肿瘤药理学。参与或承担国家 863 课题、“十二五”重大新药创制重大专项子课题、“十一五”重大新药创制重大专项子课题、天津市科技支撑计划重点项目等多项课题研究。E-mail：yanzhaopaper@163.com

作者简介：第一丁凤霞(1990-)，女，在读硕士，研究方向为肿瘤药理学。E-mail：FengxDing@126.com

基金项目：“十二五”重大新药创制科技重大专项课题(2013ZX09303001)；国家自然科学基金项目(81402481)；天津卫生局科技基金项目(2014KZ085)。