不同pH、温度、金属离子 对溶菌酶抗菌稳定性的初步研究

郭文燕,周胜男,余雅琦,伍金娥,2,常 超,2,*

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;2.武汉轻工大学教育部大宗粮油精深加工省部共建重点实验室,湖北武汉 430023)

溶菌酶(Lysozyme,LYS),又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种能水解肽聚糖的碱性酶,作用靶点是连接N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺间的β-1,4糖苷键[1-3]。肽聚糖存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中,溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有杀灭效果[4-6]。另有报道,溶菌酶能与许多外源和内源性物质结合,从而发挥其抗菌消炎、抗病毒等作用[7-9],因此溶菌酶被广泛应用于多个行业,如食品[10-11]、医药[12]等,特别用于食品防腐保鲜。目前有大量的文献报道溶菌酶用于水产品[13-14]、肉类[15-16]、果蔬[17-18]、乳品[19]储藏和保鲜,绝大多数是复合配方并且配方种类繁多,如何高效合理的运用溶菌酶是很多学者研究的热点。目前有关于溶菌酶对有机溶剂、pH和温度稳定性的研究报道[20-25],其评价指标大多采用酶的活性指标,较少采用对活菌的抑制率来评价,乙醇对溶菌酶活性无显著影响[26],但温度和pH对溶菌酶的活性有较大影响[27]。不同食品的加工条件和贮藏环境是不一样的,因此了解溶菌酶在不同的加工条件与环境下是否保持抗菌活性对指导溶菌酶的使用显得非常有意义。本文以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157∶H7为受试菌,采用溶菌酶的活菌抑制率为评价指标,系统评价不同温度、pH与金属离子对溶菌酶抗菌活性的影响,旨在阐明溶菌酶在不同条件下对病原菌抗菌活性的影响,从而为在不同食品中溶菌酶的合理利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

溶菌酶标准品(20万 U/g)、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸锌、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、硫酸锰 南京建成生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、大肠杆菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7,E.coliO157∶H7) 武汉轻工大学教育部大宗粮油精深加工省部共建重点实验室保藏;LysogenyBroth(LB)液体培养基 胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,蒸馏水,1000 mL,按常规制备培养基的方法制备,121 ℃灭菌15 min,备用;LB固体培养基 在液体培养基的基础上加入2%左右的琼脂。

Enspire酶标仪 美国Enspire公司;Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司;SW-CJ-2FD双人超净工作台 苏州净化设备有限公司;GHP-9050隔水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;YXQ-LS-70A自动高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶菌酶最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定 精确称取适量的溶菌酶干粉,溶于无菌水中。采用微量稀释法测定溶菌酶MIC[28],取两个无菌的96微孔板置于超净台上,将溶菌酶溶液用无菌水倍比稀释,分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157∶H7两种菌悬液调制相同浓度(106～107CFU/mL),加入对应的96微孔板中,使溶菌酶终浓度为0.17、0.33、0.65、1.3、2.6、5.2、11、21 mg/mL,混匀后置于37 ℃培养箱中培养24 h,于酶标仪600 nm测定其光密度值(OD值)[29]。利用肉眼观察溶液的浑浊变化与OD值相结合的方法,判定MIC值。

1.2.2 不同pH对溶菌酶抗菌活性的影响 考察溶菌酶在pH4～9范围内的抗菌活性变化,根据1.2.1确定的溶菌酶MIC设计4个溶菌酶的作用浓度(0.65、1.3、2.6、5.2 mg/mL)。将4个不同浓度溶菌酶的pH分别调至4～9,作用一段时间后,取两个无菌的96微孔板置于超净台上,将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157∶H7两种菌悬液(106～107CFU/mL)分别与上述处理后的溶菌酶等体积加入对应的96微孔板中,使溶菌酶的终浓度分别为0.33、0.65、1.3、2.6 mg/mL,混匀后放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。观察溶液的浑浊情况,于酶标仪600 nm测定OD值[29],比较不同pH下溶菌酶的抑菌稳定性。

1.2.3 不同温度对溶菌酶抗菌活性的影响 考察溶菌酶在4～121 ℃温度范围内的抗菌活性变化。将4个不同浓度的溶菌酶分别置于4、20、40、60、80、100、121 ℃条件下处理30 min,冷却后,按照1.2.2步骤加样、测OD值[29],比较不同温度处理对溶菌酶抗菌活性的影响。

1.2.4 不同金属离子对溶菌酶抗菌活性的影响 选择食品基质中具有代表性的6种金属离子考察对溶菌酶抗菌活性的影响,设计3个溶菌酶浓度,5个金属离子浓度。分别配制0.1 mol/L KCl、NaCl、ZnSO4、MnSO4、CaCl2、MgCl2母液并高温灭菌,倍比稀释至工作浓度。将系列浓度的金属离子、不同浓度的溶菌酶以及菌液分别加入对应的96微孔板中,使金属离子终浓度分别为0.15、1.25、2.5、5、10 mmol/L,溶菌酶终浓度分别为0.33、0.65、1.3 mg/mL。混匀后放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察微孔中溶液的浑浊度,测定OD值,计算抑制率[30],溶菌酶对照中金属离子浓度为0。

抑制率(%)=[(溶菌酶对照吸光值-金属离子溶菌酶联用吸光值)/溶菌酶对照吸光值]×100

式(1)

1.2.5 Zn2+对溶菌酶协同抗菌的验证 根据1.2.4的结果筛选出协同效果最强的Zn2+,将比较对象变为空白对照组,验证Zn2+对溶菌酶协同抗菌效果。设计4个Zn2+浓度0.15、0.6、2.5、10 mmol/L,3个溶菌酶浓度0.33、0.65、1.3 mg/mL。具体操作同1.2.4所示。抑制率计算[30]公式如下,空白对照中Zn2+、溶菌酶浓度均为0。

抑制率(%)=[(空白对照吸光值-Zn2+溶菌酶联用吸光值)/空白对照吸光值]×100

1.2.6 数据统计分析 实验均重复3次,用平均值±标准偏差表示。采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对实验数据进行方差分析和显著性测验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 溶菌酶最小抑菌浓度

不同浓度的溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157∶H7抑制趋势见图1,溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制随着浓度的增加而增强,当浓度超过1.3×10-3g/mL,OD值趋于平缓,并且培养液澄清透明,由此判断溶菌酶对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为1.3×10-3g/mL,同样的方法判断溶菌酶对大肠杆菌O157∶H7最小抑菌浓度为2.6×10-3g/mL。由图1变化趋势可知,相同浓度的溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制效果强于大肠杆菌O157∶H7,这与溶菌酶水解肽聚糖的抑菌机制有关,金黄色葡萄球菌细胞壁中肽聚糖的含量比大肠杆菌O157∶H7细胞壁中含量高[31]。

图1 不同浓度溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157∶H7生长的影响Fig.1 Effect of different concentrations of LYS against S. aureus and E. coli O157∶H7

2.2 不同pH对溶菌酶抗菌活性的影响

4个不同浓度的溶菌酶经过不同pH处理后对两种细菌的抑制结果见图2,由图2A可知,溶菌酶在高浓度(超过MIC)时,pH变化对溶菌酶抑制大肠杆菌O157∶H7的影响较小,浓度越高,影响越小。但溶菌酶在低浓度(小于MIC)时,pH变化对溶菌酶抑制大肠杆菌O157∶H7的影响较大,随着pH升高,OD值升高,抑制效果减弱。当pH小于7即酸性条件,溶菌酶对大肠杆菌O157∶H7抑制效果要强于碱性条件,说明溶菌酶在酸性条件稳定性较好,抑菌效果较碱性条件下显著,这可能是在碱性条件下,溶菌酶结构易被破坏,酶活性降低使得溶菌酶抗菌效果降低,这与刘慧研究结果基本一致[32]。对比图2A和图2B可知,金黄色葡萄球菌与大肠杆菌O157∶H7具有类似的变化趋势。综合图2可以看出,溶菌酶在pH4～6具有更好的稳定性,对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌O157∶H7均具有较好的抑菌效果。这些结果表明,溶菌酶优先用于酸性食品的储藏保鲜,用作碱性的食品保藏时,需提高溶菌酶的浓度。

图2 不同pH对溶菌酶抑菌活性的影响Fig.2 Effect of pH values on antibacterial activity of LYS注：A：大肠杆菌O157∶H7;B：金黄色葡萄球菌。

2.3 不同温度对溶菌酶抗菌活性的影响

4个不同浓度的溶菌酶经过不同温度处理后对两种细菌的抑制结果见图3,由图3可知,溶菌酶在高浓度(超过MIC)和低浓度(小于MIC)时,温度升高,OD值波动范围较小,说明温度变化对溶菌酶抑制大肠杆菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌的影响甚微,抗菌活性不受影响。该结果与Cosentino等[33]报道一致,浓缩和杀菌处理不影响溶菌酶的浓度或抗菌活性。温度实验结果综合表明,溶菌酶具有较强的热稳定性,在食品加工的温度范围内,其抗菌活性几乎不受影响,适合用于冷热食品的保藏保鲜。

图3 不同温度对溶菌酶抑菌活性的影响Fig.3 Effect of thermal treatments on antibacterial activity of LYS注：A：大肠杆菌O157∶H7;B：金黄色葡萄球菌。

2.4 不同金属离子对溶菌酶抗菌活性的影响

3个不同浓度的溶菌酶经过不同金属离子作用后对两种细菌的抑制结果见图4和图5,由图4可知,Zn2+与Mn2+可以增强溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制作用,具有协同抑菌效应,其中以Zn2+最为显著,并且Zn2+在低浓度(0.15 mmol/L)可以表现出很强的抑制作用,而Mn2+则需要在较高浓度(2.5 mmol/L)才能表现出较强的抑制作用。Zn2+表现出较强的协同抑菌效应,其原因可能与Zn2+本身具有一定的抗菌能力有关。有文献报道,大多数细菌细胞膜带负电荷,Zn2+的正电荷在静电作用下与细菌的细胞膜接触,从而使细菌生长受阻或死亡[34],具有与溶菌酶不同的抗菌途径,从而起到协同抑菌效应。相反,Mg2+与K+可以抵消溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制效果,具有拮抗抑菌效应,其中以Mg2+最为显著,可以促进金黄色葡萄球菌的生长,其原因可能是细菌在生长过程中需要Mg2+的参与,特别是激活细菌的有些酶系。而Na+与Ca2+仅表现出较弱的协同抑菌效应,对溶菌酶抑制金黄色葡萄球菌的效果影响较小。

图4 不同金属离子对溶菌酶抑制金黄色葡萄球菌效果的影响Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against S. aureus注：A：溶菌酶浓度0.33 mg/L;B:溶菌酶浓度0.65 mg/L;C:溶菌酶浓度1.3 mg/L。

对比图4和图5,不同金属离子对溶菌酶抑制大肠杆菌O157∶H7的效果与金黄色葡萄球菌类似,Zn2+与Mn2+同样可以增强溶菌酶对大肠杆菌O157∶H7的抑制作用,Mn2+在溶菌酶高浓度时展现出更强的抑制作用(图5C)。Mg2+同样

图5 不同金属离子对溶菌酶抑制大肠杆菌O157∶H7效果的影响Fig.5 Effect of metal ions on antibacterial activity of LYS against E. coli O157∶H7注：A：溶菌酶浓度0.33 mg/L； B：溶菌酶浓度0.65 mg/L;C：溶菌酶浓度1.3 mg/L。

可以抵消溶菌酶对大肠杆菌O157∶H7的抑制效果,但Ca2+则呈现与Mg2+类似的拮抗抑菌效应,可能原因是大肠杆菌O157∶H7生长过程中,需要Ca2+参与下合成蛋白酶[34]。综合图4、图5结果表明,溶菌酶用于食品储藏保鲜时,应避免在基质中含有较多Ca2+、Mg2+的食品中使用,优先考虑富含Zn2+、Mn2+的食品中使用,必要时可以通过添加Zn2+提高溶菌酶的抗菌效果。

2.5 Zn2+对溶菌酶协同抗菌的验证

Zn2+对溶菌酶协同抗菌的验证结果见图6,图6结果表明,Zn2+与溶菌酶联合使用的抑菌效果要强于单一的Zn2+,具有协同抗菌效应,但Zn2+在高浓度(10 mmol/L)时,与溶菌酶无协同抗菌效应,其原因是过高的Zn2+完全抑制了细菌生长[35]。而图4、图5结果显示,Zn2+与溶菌酶联合使用的抑菌效果要强于单一的溶菌酶,综合图4、图5、图6结果表明,Zn2+对溶菌酶具有协同抗菌效应。

图6 Zn2+对溶菌酶协同抗菌的验证Fig.6 Validation of synergistic antibacterial activity of Zn2+ and LYS注：A:大肠杆菌O157∶H7；B:金黄色葡萄球菌。

3 结论

本研究以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以大肠杆菌O157∶H7为代表的革兰氏阴性菌为受试菌,系统研究了温度、pH、金属离子对溶菌酶抗菌活性的影响。结果显示,溶菌酶在pH4～6具有更好的稳定性,适用于酸性食品的储藏保鲜,在碱性环境下,需提高溶菌酶的剂量。在4～121 ℃下,溶菌酶具有良好的热稳定性。溶菌酶与Mn2+、Zn2+具有一定的协同抗菌效应,而与Ca2+、Mg2+具有一定的拮抗抗菌效应,抗菌效果会受到一定程度的减弱,协同或拮抗抗菌效应的原因和机制有待进一步深入研究和分析。

[1]冯棋琴,周立梅,高文功,等. 溶菌酶在食品工业中的研究进展[J]. 食品研究与开发,2015(5):134-136.

[2]Kozuka M,Murao S,Yamane T,et al. Rapid and simple purification of lysozyme from the egg shell membrane[J]. Journal of Nutritional Science & Vitaminology,2015,61(1):101-103.

[3]Liu Z,GarcãA-DäAz B,Catacchio B,et al. Protecting gram-negative bacterial cell envelopes from human lysozyme:interactions with ivy inhibitor proteins from escherichia coli and pseudomonas aeruginosa[J]. Biochim Biophys Acta,2015,1848(11):3032-3046.

[4]费国琴,李晓晖,宁喜斌,等. 微生物溶菌酶酶学性质及抑菌特性研究[J]. 江苏农业科学,2012,40(9):286-287.

[5]Liburdi K,Benucci I,Esti M. Lysozyme in Wine:An Overview of Current and Future Applications[J]. Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety,2014,13(5):1062-1073.

[6]温赛,刘怀然,续丹丹. 溶菌酶及其分子改造研究进展[J].中国生物工程杂志,2015,35(8):116-125.

[7]Cappannella E,Benucci I,Lombardelli C,et al. Immobilized lysozyme for the continuous lysis of lactic bacteria in wine:Bench-scale fluidized-bed reactor study[J]. Food Chemistry,2016,210:49.

[8]Guzzo F,Cappello M S,Azzolini M,et al. The inhibitory effects of wine phenolics on lysozyme activity against lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,148(3):184-190.

[9]Azzolini M,Tosi E,Veneri G,et al. Evaluating the efficacy of lysozyme against lactic acid bacteria under different winemaking scenarios[J]. South African Journal for Enology & Viticulture,2010,31(2):99-105.

[10]卢小菊,孟鸳. 溶菌酶与壳聚糖复配液抑菌作用的研究[J]. 中国食品添加剂,2016(2):51-56.

[11]Wang Z,Hu S,Gao Y,et al. Effect of collagen-lysozyme coating on fresh-salmon fillets preservation[J]. LWT-Food Science and Technology,2017,75:59-64.

[12]Lasanta C,Roldán A,Caro I,et al. Use of lysozyme for the prevention and treatment of heterolactic fermentation in the biological aging of sherry wines.[J]. Food Control,2010,21(11):1442-1447.

[13]朱迎春,马俪珍,党晓燕,等. 不同天然保鲜液对气调包装冰温贮藏鲶鱼片品质的影响[J]. 农业工程学报,2017,33(1):292-300.

[14]施建兵,谢晶,高志立,等. 响应面法优化鲳鱼复合生物保鲜剂配方[J]. 食品科学,2014,35(20):37-42.

[15]陈亚莉,杨秀华,王远亮,等. 冷却肉天然复合保鲜剂配比的优化[J]. 食品科学,2010,31(8):84-90.

[16]杨万根,李满凤,朱秋劲,等. 冷鲜牛肉复合天然减菌剂的筛选及优化[J]. 食品与发酵工业,2015,41(2):30-34.

[17]鲁奇林,赵宏侠,冯叙桥,等. 溶菌酶复合涂膜贮藏鲜枣工艺研究[J]. 中国食品学报,2015,15(1):115-122.

[18]范林林,冯叙桥. 不同保鲜处理对鲜切苹果保鲜效果的影响[J]. 食品与发酵工业,2015,41(1):252-256.

[19]张明江,孙敏杰,王麟艳,等. 婴幼儿配方奶粉中溶菌酶添加工艺的研究[J]. 现代食品科技,2009,25(4):405-407.

[20]Tirelli A,De N I. Evaluation of lysozyme stability in young red wine and model systems by a validated HPLC method[J]. Food Chemistry,2007,105(4):1564-1570.

[21]Polidori P,Vincenzetti S. Effects of thermal treatments on donkey milk nutritional characteristics[J]. International Journal of Food Engineering,2013,7(5):182-187.

[22]Li D,Zhang T,Xu C,et al. Effect of pH on the interaction of baicalein with lysozyme by spectroscopic approaches[J]. Journal of Photochemistry & Photobiology B Biology,2011,104(3):414-424.

[23]Li D,Cao X,Ji B. Spectrophotometric studies on the interaction between myricetin and lysozyme in the absence or presence of Cu2+or Fe3+[J]. Journal of Luminescence,2010,130(10):1893-1900.

[24]Benucci I,Cappannella E,Liburdi K,et al. Inhibitory effect of ethanol,sulphur dioxide and proanthocyanidinic tannins on lysozyme antimicrobial activity in model wine[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,73:320-325.

[25]Dehkordi S S S,Rohani S M R,Tajik H,et al. Antimicrobial Effects of Lysozyme in Combination with Zataria multiflora Boiss. Essential Oil at Different pH and NaCl Concentrations onE.coliO157∶H7 andStaphylococcusaureus[J]. Journal of Animal & Veterinary Advances,2008,7(11):1458-1463.

[26]Ji S,Thulstrup P W,Mu H,et al. Effect of ethanol as a co-solvent on the aerosol performance and stability of spray-dried lysozyme.[J]. International Journal of Pharmaceutics,2016,513(1-2):175-182.

[27]Freitas D S,Abrahão-Neto J. Biochemical and biophysical characterization of lysozyme modified by pegylation[J]. International Journal of Pharmaceutics,2010,392(1-2):111-117.

[28]陈奕雯,陈华,许爱萍. 微量肉汤稀释法检测中药香囊挥发油对5种呼吸道致病菌抗菌作用[J]. 检验医学与临床,2015(1):85-86.

[29]Cugnata N M,Guaspari E,Pellegrini M C,et al. Optimal concentration of organic solvents to be used in the broth microdilution method to determine the antimicrobial activity of natural products against paenibacillus larvae[J]. Journal of Apicultural Science,2017,61(1):37-53.

[30]姜晨,增田泰伸,木村守,等. 复配抑菌剂对单增李斯特菌的抑制作用及其保鲜效果[J]. 食品工业科技,2017,38(8):92-97.

[31]崔红. 天然微生物防腐剂溶菌酶在食品中的应用研究[J]. 中国食物与营养,2015,21(12):28-31.

[32]刘慧. 溶菌酶滴眼液的研制及对兔细菌性角膜炎模型的作用研究[D]. 济南:山东大学,2009.

[33]Cosentino C,Labella C,Elshafie H S,et al. Effects of different heat treatments on lysozyme quantity and antimicrobial activity of jenny milk[J]. Journal of Dairy Science,2016,99(7):5173-5179.

[34]李吉东,李玉宝,王学江,等. 载铜锌纳米羟基磷灰石的抗菌性能及机理研究[J]. 无机材料学报,2006,21(1):162-168.

[35]Zhao X,Yang J,You J. Surface modification of TiO2,coatings by Zn ion implantation for improving antibacterial activities[J]. Bulletin of Materials Science,2016,39(1):285-291.