MMP-9、AECA、ANCA蛋白在川崎病外周血的表达及其与冠状动脉损害的关系

王晓华，王倩，赵建美

(南通大学附属医院，江苏南通226001)



MMP-9、AECA、ANCA蛋白在川崎病外周血的表达及其与冠状动脉损害的关系

王晓华，王倩，赵建美

(南通大学附属医院，江苏南通226001)

摘要：目的探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、抗内皮细胞抗体(AECA)和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)在川崎病(KD)冠状动脉损害中的作用及临床意义。方法选取KD患儿42例，分为冠脉损害(CAL)组16例，无冠脉损害(NCAL)组26例，以20例普通发热患儿、15例择期手术患儿作为对照组。ELISA检测各组血清MMP-9、AECA和ANCA蛋白水平；荧光定量PCR、明胶酶谱法分别测定单个核细胞MMP-9 mRNA表达及血清MMP-9酶活性。结果KD急性期外周血MMP-9 mRNA表达、蛋白水平及酶活性均高于两对照组(P均<0.01)，CAL组较NCAL组升高更显著(P均<0.05)。KD缓解期MMP-9 mRNA表达、蛋白水平及酶活性较急性期降低(P均<0.01)。KD急性期AECA、ANCA蛋白水平均高于两对照组(P均<0.01)。CAL组ANCA蛋白水平高于NCAL组(P<0.01)。KD急性期血清AECA水平与MMP-9呈正相关(r=0.77，P<0.01)。急性期CAL组MMP-9、ANCA与冠状动脉内径/主动脉瓣环内径比值呈正相关关系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。结果MMP-9、AECA、ANCA蛋白参与KD血管炎及冠脉损害过程，检测其血清水平对早期预测冠脉损害有一定价值。

关键词：川崎病；基质金属蛋白酶-9；抗内皮细胞抗体；抗中性粒细胞胞质抗体；冠状动脉损害

川崎病(KD)是一种病因不明的全身中小血管炎性疾病，该病最严重的并发症是冠状动脉损害，约4%的患儿因冠状动脉狭窄导致成人期缺血性心脏病。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是由内皮细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞等合成分泌的具有降解细胞外基质作用的蛋白酶。抗内皮细胞抗体(AECA)和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)是存在于循环中的自身抗体，被视为原发性小血管炎特异的血清标志[1,2]，与多种血管炎性免疫性疾病有关。本研究观察KD患儿外周血MMP-9、ANCA、AECA水平变化，探讨KD血管炎及冠状动脉损害的病理机制，为预测KD冠脉损伤及预后判断提供理论依据。

1资料与方法

1.1 临床资料 2012年6月～2013年12月本院诊断明确KD患儿42例，男25例、女17例，年龄(24.2±21.2)月；均符合第七次世界小儿KD研讨会修订的诊断标准[3]。42例患儿中，冠脉损害16例(CAL组)、左冠状动脉内径(LCA)/主动脉瓣环内径(AAO)比值为0.26±0.04，无冠脉损害26例、LCA/AAO比值为0.16±0.02。超声心动图冠脉损害判断标准：①冠状动脉内膜回声增强；②LCA超过邻近节段内径的1.5倍；③LCA/AAO比值>0.2[4]。CAL组16例中，单纯冠状动脉内膜回声增强2例，LCA/AAO比值>0.2者14例(其中3例伴管壁内膜回声增强，1例同时有LCA超过邻近节段内径的1.5倍)。随机选取年龄、性别相仿的同期住院发热(体温≥38.5 ℃，主要为下呼吸道感染)患儿20例和儿外科择期手术患儿15例分别作为发热对照组和正常对照组。各组年龄、性别差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2血液样品采集分别于KD急性期(治疗前)及缓解期(治疗7~10 d)各采集外周静脉血5 mL，取3 mL全血立即注入肝素抗凝试管，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，细胞经计数后用于实时定量PCR检测。另2 mL血离心后取血清，保存于-80 ℃冰箱待测。两对照组患儿只采血1次，样品处理方法同上。

1.3血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白水平检测人MMP-9、AECA、ANCA ELISA试剂盒均购自美国R&D公司，严格按照试剂盒说明书的步骤操作，根据试剂盒中的标准品进行定量检测。

1.4单个核细胞MMP-9 mRNA表达检测采用荧光定量PCR法。在分离的外周血单个核细胞中加1 mL TRIzol匀浆，依次经过氯仿、异丙醇等提取总RNA，逆转录反应体系10 μL。取1μL cDNA行PCR，反应体系20 μL：Fast SYBR Green Master Mix(Roche) 10 μL，上下游引物各1μL，ddH2O 7μL，反应条件：95 ℃预变性5 min, 共45个循环(95 ℃、20 s，63 ℃、20 s，72 ℃、40 s)。

1.5血清MMP-9酶活性测定采用明胶酶谱法。冷冻血清室温解冻后，取20 μL与等体积上样缓冲液混匀，于含1%明胶溶液的10%丙烯酰胺凝胶垂直电泳槽中电泳，电泳结束后凝胶用含Triton X-100的明胶洗脱液振荡洗涤1 h以洗去SDS。37 ℃孵育24 h，0.1%考马斯亮蓝染液染色约30 min，A、B、C脱色液(由甲醇、乙酸、三蒸水配制)脱色1 h，直至蓝色背景上出现白色条带。用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值为相对定量样品中酶活性大小。

2结果

2.1各组血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及单个核细胞MMP-9 mRNA表达见表1。

表1　各组血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及单个核细胞MMP-9 mRNA表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与发热对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与KD组缓解期比较，#P<0.01。

2.2CAL组、NCAL组血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及单个核细胞MMP-9 mRNA表达见表2。

表2　CAL组、NCAL组血清MMP-9、AECA、ANCA蛋白及单个核细胞MMP-9 mRNA表达比较

注：与NCAL组同期比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.3各组外周血清MMP-9酶活性血清MMP-9酶活性净光密度值CAL组急性期、缓解期分别为13.19±4.07、4.80±2.01，NCAL组分别为9.61±3.01、4.68±1.99，发热对照组为4.92±1.26，正常对照组为2.65±0.99。CAL组、NCAL组急性期与缓解期比较血清MMP-9酶活性有统计学差异(P均<0.01)；CAL组、NCAL组急性期与发热对照组、正常对照组比较血清MMP-9酶活性有统计学差异(P均<0.01)。

2.4各检查指标的相关性KD急性期血清AECA水平与MMP-9水平呈正相关关系(r=0.77，P<0.01)。CAL组急性期血清MMP-9、ANCA水平均与LCA/AAO比值呈正相关关系(r=0.57，P<0.05；r=0.88，P<0.01)。

3讨论

在MMPs超家族中，MMP-9与KD血管病变关系最为紧密。MMP-9能够降解胶原酶和弹性蛋白酶，破坏血管内膜的内皮下层，有利于中性粒细胞、单核/巨噬细胞等向血管壁深层浸润，导致血管壁结构的破坏[5]。Sakata等[6]在死亡KD患儿的冠状动脉标本中检测到异常增高的MMP-9，且发现急性期血清MMP-9水平高于对照组。我们的研究显示，KD急性期MMP-9 mRNA和蛋白表达都增高，CAL组增高更显著。由于在机体内发挥降解细胞外基质作用的只有激活状态的MMP-9，即MMP-9酶，血清MMP-9蛋白水平升高不代表MMP-9酶活性增强，因此我们又测定外周血清MMP-9酶活性。结果显示，KD急性期MMP-9酶活性亦增强，在CAL组尤为明显。相关分析提示血清MMP-9与LCA/AAO比值呈正相关，即与冠脉损害严重程度呈正相关。故监测外周血MMP-9蛋白水平可了解血管基底膜降解情况，有助于早期预测冠状动脉损害。

内皮细胞功能异常是导致KD血管炎及并发冠状动脉损害的重要环节。AECA是B淋巴细胞产生的非特异性的自身抗体，与内皮细胞结合后可以通过以下途径介导血管内皮损伤和功能障碍：①上调内皮细胞表面黏附分子的表达，吸引单核细胞、中性粒细胞的迁移和聚集；②增加炎性细胞因子、趋化因子的合成，活化内皮细胞；③通过补体或抗体的细胞毒作用引起内皮细胞的损伤和溶解；④与磷脂或者热休克蛋白60结合诱导内皮细胞凋亡；⑤刺激内皮细胞产生血管性假血友病因子、组织因子，促进血栓形成[1,7,8]。早期研究显示，AECA水平与KD患儿疾病的活动性相关，治疗后AECA水平下降[9]。本研究显示，KD组血清AECA水平高于两对照组，但CAL组与NCAL组无差异，CAL组血清AECA与LCA/AAO比值也无相关性。由此可见，虽然AECA介导内皮损伤及功能障碍是引起KD血管炎及冠脉损害的因素之一，但急性期血清AECA增高不能预测是否并发冠状动脉损害。

ANCA作用主要表现为介导中性粒细胞的活化、释放活性氧、细胞因子、蛋白溶解酶等毒性介质，诱发内皮细胞损伤，导致局部血管功能异常[10，11]。近年来ANCA与KD的相关研究各家报道存在争议[12，13]。我们结果显示，KD急性期ANCA水平高于两对照组，CAL组升高更明显，CAL组血清ANCA与LCA/AAO比值呈正相关；缓解期ANCA水平降低。提示ANCA与KD病情活动有关，且在冠脉损害过程中发挥一定作用，检测血清ANCA水平对冠脉损害的发生有预警意义。

综上所述，MMP-9降解血管壁细胞外基质，AECA、ANCA损伤血管内皮细胞，三者均作为重要致病因素参与KD血管炎及冠状动脉损害的发生发展；MMP-9与AECA可能通过细胞因子和炎症细胞介导存在协同增强作用；检测血清MMP-9和ANCA蛋白水平对于早期预测冠脉损害有一定指导价值。

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Expression of MMP-9, AECA and ANCA in peripheral blood of patients with Kawasaki disease and its relationship with coronary artery lesions

WANGXiaohua,WANGQian,ZHAOJianmei

(TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the potential role and clinical significance of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), anti-endothelial cell antibodies (AECA) and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) in vasculitis and coronary artery lesions (CAL) of patients with Kawasaki disease (KD). MethodsForty-two children with KD were divided into two groups: CAL group (n=16) and non-coronary artery lesion (NCAL) group (n=26). Twenty febrile children and 15 children for selective operation were chosen as the control group. Serum levels of MMP-9, AECA and ANCA were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence quantitative-PCR and gelatin zymography were respectively used to detect MMP-9 mRNA expression and enzyme activity. ResultsThe MMP-9 mRNA expression, protein level and enzymatic activity in the acute phase of KD patients were all higher than those in the two control groups (all P<0.01), and they were significantly higher in the CAL group than in the NCAL group (all P<0.05). Moreover, MMP-9 mRNA expression, enzymatic activity and protein level were decreased significantly in the remission phase (all P<0.01). Serum AECA and ANCA protein levels of KD patients in the acute phase were significantly higher as compared with those of the two control groups (all P<0.01). The protein level of ANCA in the CAL group was significantly higher than that of the NCAL group (P<0.01). There was a positive correlation between serum MMP-9 and AECA protein in the acute phase of KD (r=0.77, P<0.01). The serum MMP-9 and ANCA protein levels of the CAL group in the acute phase were both positively correlated with LCA/AAO ratio (r=0.57, P<0.05; r=0.88, P<0.01). ConclusionsMMP-9, AECA and ANCA are potential pathological factors in the formation of KD vasculitis and CAL. The serum level detection has a certain value for early prediction of CAL.

Key words:Kawasaki disease; matrix metalloproteinase 9; anti-endothelial cell antibody; anti-neutrophil cytoplasmic antibody; coronary artery lesions

(收稿日期：2015-11-05)

通信作者简介：赵建美(1971-)，女，主任医师，医学博士，硕士生导师，主要从事川崎病发病机制及干预的研究，为江苏省“六大人才高峰”人才、南通市“226”人才培养对象。近五年主持江苏省卫生厅、江苏省人力资源社会保障厅医学项目各1项，参与国家自然科学基金面上项目1项，获江苏省卫生厅新技术引进二等奖2项。E-mail：zjmheart@163.com

中图分类号：R725.4

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.004

作者简介：第一王晓华(1988-)，女，住院医师，医学硕士，主要研究方向为儿童感染及心血管疾病。E-mail：sherran004@126.com

基金项目：江苏省卫生厅资助科研项目(H201423)；2015年度南通市市级科技计划项目。