荧光光谱法研究亮蓝与溶菌酶的相互作用

2019-06-26张彦青王晓红

山东化工 2019年11期

张彦青，王晓红

(衡水学院化工学院，河北衡水 053000)

亮蓝色素是一种常见的食用合成色素，合成成本较低，应用广泛。溶菌酶是一种的天然蛋白质，在人体多种组织中都广泛存在，稳定性很好，耐热，可在干燥条件下长期保存，分子质量较小。溶菌酶与药物的相互作用方面的文献报道不少[1-3]，但研究溶菌酶与食用合成色素结合相互作用的文献不多。本文利用荧光光谱法研究亮蓝与溶菌酶之间的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

主要仪器：FA2204B电子天平-上海精密科学仪器股份有限公司；F-7000荧光分析仪-日立。

试剂：亮蓝-天津多福源实业有限公司；溶菌酶-上海伯奥生物科技有限公司。

2×10-5mol·L-1溶菌酶标准储备溶液；1×10-4mol·L-1亮蓝标准溶液。本实验所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 荧光光谱分析

分别移取1.0×10-4mol/L的亮蓝标准溶液0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL比色管中，再分别加入2×10-5mol/L溶菌酶标准储备溶液1 mL，用二次蒸馏水定容，配成亮蓝-溶菌酶体系溶液，配置成三组，分别至于290、304、323 K三种不同的温度水浴锅中，稳定10 min，设置激发波长为280 nm、激发和发射单元狭缝均为5.0 nm，在波长范围300～450 nm内扫描亮蓝-溶菌酶体系的荧光谱图。

1.2.2 同步荧光光谱分析

分别吸取1.0×10-4mol/L的亮蓝标准溶液0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL比色管中，再分别加入2×10-5mol/L溶菌酶标准储备溶液1 mL，用二次蒸馏水定容，配制成以亮蓝为变量的亮蓝-溶菌酶体系溶液，设定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，扫描同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 亮蓝与溶菌酶体系的有荧光猝灭机理

2.1.1 荧光光谱

由图1可知，溶菌酶在344 nm处有最高峰值，随着亮蓝浓度的逐渐增高，溶菌酶的强度明显下降，说明亮蓝对于溶菌酶有猝灭作用[11]这说明亮蓝对溶菌酶能够产生荧光猝灭，更进一步说明两者可以发生相互作用。按方程(1)进行处理，数据如图2。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q] (1)

式中Ksv为猝灭常数，L·mol-1；[Q]为亮蓝的浓度，mol-1·L；Kq是速率常数，L·mol-1·s-1；τ0为无猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命，s。

根据直线的斜率可求得温度为290、304、323 K时的动态猝灭常数Ksv分别为7.70×104，4.17×104，3.41×104mol/L，Kq分别为7.70×1012，4.17×1012，3.41×1012mol/L，相关系数分别为0.9982，0.9976，0.9974，表明各条曲线呈线性。而亮蓝对溶菌酶的猝灭常数Ksv随温度升高而降低，表明只存在一种猝灭类型。通常情况下认为，各种荧光猝灭剂对生物大分子的动态猝灭速率常数的最大值约为2.0×1010L·mol-1·s-1。本实验在290、304、323 K时亮蓝对溶菌酶的猝灭常数远大于2.0×1010L·mol-1·s-1，因此可知亮蓝对溶菌酶的猝灭过程属于静态猝灭。

图1 290 K亮蓝-溶菌酶体系荧光光谱图

图2 不同温度时亮蓝对溶菌酶的荧光猝灭Stern-Volmer曲线

2.1.2 亮蓝-溶菌酶的结合常数

对于静态猝灭，亮蓝-溶菌酶作用之间的结合常数、结合位点数用公式(2)[4]求得

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q] (2)

式中：F0、F分别为加入亮蓝前后溶菌酶的荧光强度；K为结合常数，L·mol-1；n为结合位点数；[Q]为亮蓝的浓度，mol-1·L。由表1可知在不同的温度体系下结合常数K较大，说明两者之间的结合作用较大。

2.1.3 热力学参数

化学小分子与生物大分子之间的作用力通常有有疏水作用、范德华力、氢键作用、静电作用[5]，它们间的作用力可以根据反应前后热力学焓变(ΔH)和熵变(ΔS)的相对大小求得。即ΔH>0，ΔS<0，主要为疏水作用；若ΔH<0，ΔS<0，则主要是范德华力和氢键作用；若ΔH<0，ΔS>0，则是静电作用。根据公式 (3)(4)(5)可求得ΔH，△G和ΔS，结果见表1。由表1可知，不同温度下的△G均小于0，表明亮蓝和溶菌酶之间的相互作用是自发的。由焓变和熵变可知，亮蓝与溶菌酶之间的主要作用力为范德华力和氢键[13]。

ln(K2/K1) =(1/T1-1/T2)(ΔH/R) (3)

ΔG=-RTlnK (4)

ΔG=ΔH-TΔS (5)