多靶点鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗肿瘤多药耐药作用机制研究

张　元，王　火，牛　聪，曹　波，陈　虹

( 1．武警新疆总队南疆指挥部医院，新疆喀什　844000;2．武警后勤学院附属医院，天津　300162; 3．武警总医院，北京　100039;4．武警后勤学院，天津　300309)



多靶点鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗肿瘤多药耐药作用机制研究

张元1，王火2，牛聪3，曹波4，陈虹4

( 1．武警新疆总队南疆指挥部医院，新疆喀什844000;2．武警后勤学院附属医院，天津300162; 3．武警总医院，北京100039;4．武警后勤学院，天津300309)

中国图书分类号: R-332; R329. 24; R329. 25; R341; R730. 53; R979. 19

关键词:鬼臼毒素衍生物;多靶点; P糖蛋白;抗肿瘤;抗多药耐药;微管蛋白

曹波( 1981－)，男，博士，讲师，研究方向:肿瘤药理学，通讯作者，E-mail: caobo19841@126．com

Anti-MDR tumor activities of CCP-1: a new multi-target podophyllotoxin derivative and its molecular mechanism

ZHANG Yuan1，WANG Huo2，NIU Cong3，CAO Bo4，CHEN Hong4
( 1．Xinjiang Provincial Corps South-region Command Post Hospital of CAPF，Kashgar Xinjiang844000，China; 2．Affiliated Hospital of Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China; 3．General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China; 4．Logistics University of CAPF，Tianjin 300309，China)

Key words:podophyllotoxin derivatives; multi-target; P-gp; anti-tumor; anti-MDR;tubulin

以往单一靶点的抗肿瘤药物极易产生耐药［1－3］。多靶点的化疗药物具有其独特优势，如多靶点的化疗药物是单分子化合物，不存在多药物联合应用中的药物相互作用问题，也可避免药物联合应用中药物配伍、剂量、给药方式等问题。本课题组以天然产物中鬼臼毒素为母核，整合了具有抗肿瘤耐药的小分子片段，将鬼臼毒素新衍生物设计为同时作用于多个耐药靶点的化合物，以更好的克服传统单靶点化疗药物易产生多药耐药的缺陷。前期筛选发现衍生物CCP-1具有良好的抗肿瘤多药耐药的作用。本文将对CCP-1的体内和体外抗肿瘤作用及其可能作用机制作初步探讨。

1　材料与方法

1．1一般材料CCP-1，分子质量614. 6。依托泊苷( etoposide，VP-16)，分子质量588. 56。人口腔鳞癌细胞KB及其长春新碱耐药细胞株KBv200，人慢性髓性白血病急变期细胞K562及其阿霉素耐药株K562/A02培养于RPMI 1640培养基中。♂昆明种小鼠，体质量18～22 g，SPF级。动物移植性肿瘤S180肉瘤由天津药物研究院传代保种。

1．2方法

1．2．1 MTT法测定CCP-1对多药耐药细胞的抗肿瘤活性按照文献［4］方法进行测定。

1．2．2流式细胞仪检测CCP-1对KBv200细胞凋亡率的影响加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，进行流式细胞仪检测。

1．2．3 CCP-1对耐药相关基因mdr-1表达的影响加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)处理细胞。PCR分析:βactin作为内标，靶基因为mdr-1。

1．2．4免疫细胞化学法观察CCP-1对KBv200细胞P-gp蛋白表达的影响［5］加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，滴加兔抗人多克隆抗体(稀释比例为1∶200)、鼠抗兔IgG二抗。光镜观察并照相。

1．2．5免疫荧光法检测CCP-1对KBv200细胞微管蛋白的影响给药组加入等浓度的CCP-1、长春新碱和紫杉醇，滴加兔抗人多克隆抗体、FITC标记的鼠抗兔IgG二抗、DAPI染液，高内涵成像系统检测并拍照。

1．2．6动物移植肿瘤模型研究CCP-1体内抗肿瘤作用按照文献［6］方法进行测定。

1．2．7统计学分析采用SPSS17．0统计软件包处理分析数据，数据用±s表示，采用单因素方差分析( One-way ANOA)，显著性水准为0. 05。

2　结果

2．1MTT法测定CCP-1对体外培养细胞增殖的影响从Tab 1、2可以看出CCP-1对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤作用( IC50: 1. 41～3. 34 μmol·L－1)，与VP-16相比CCP-1显示了更强的抗肿瘤活性，且对多药耐药细胞株的杀伤作用明显高于临床上广泛使用的VP-16。

2．2流式细胞仪检测CCP-1对KBv200细胞凋亡率的影响

CCP-1( 1. 0～4. 0 μmol·L－1)可诱导KBv200细胞产生凋亡，且有明显量效关系。

2．3CCP-1对mdr-1基因mRNA表达的影响本研究发现CCP-1随给药浓度的增加可使mdr-1的mRNA表达量减少，有较明显的剂量依赖性。

2．4免疫细胞化学法观察CCP-1对KBv200细胞P-gp蛋白表达的影响实验结果显示，随剂量的增加，CCP-1有降低P-gp蛋白表达的明显趋势。

2．5免疫荧光法检测CCP-1对KBv200细胞微管蛋白的影响实验显示长春新碱能够阻止微管结构的合成，而CCP-1作用于KBv200细胞6 h后，与紫杉醇作用结果相似，能够促进微管聚合、抑制微管解聚。

2．6CCP-1对小鼠实体型S180肉瘤的抑制作用腹腔注射CCP-1( 25、50 mg·kg－1·d－1)，对小鼠实体型S180肉瘤的生长抑制率分别为55. 11%和62. 72%。在小鼠体重方面，高低剂量组与阴性对照组相比较未见明显减轻( P＞0. 05)。阳性对照组依托泊苷( 20 mg·kg－1·d－1)抑瘤率为58. 54%，但小鼠体重与阴性对照组相比有明显降低(体重下降20%)，且出现动物死亡现象(死亡4只)。

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

IC50/μmol·L－1KB　KBv200　Mult of Drug fast Vincristine　0．28±0．07　9．25±1．03　33．04 Etoposide　1．71±0．04　12．1±1．23　7．07＊＊CCP-1　1．41±0．06　2．06±0．38＊＊　1．46＊＊

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

ADM　0．34±0．11　12．22±1．25　35．94 Etoposide　3．56±0．23　34．76±4．23　9．76＊＊CCP-1　1．02±0．58　3．34±1．12＊＊　3．27＊＊IC50/μmol·L－1K562　K562/A02　Mult of Drug fast

Tab 3 Inhibitory effect of CCP-1 on transplantable sarcoma S180 in mice( n =10 per group)

Fig 1 Chemical structure of CCP-1

3　讨论

本实验室通过结构改造和构效关系的研究，引入活性基团，合成了一系列结构新颖的鬼臼毒素衍生物，其中CCP-1是将小分子5-甲氧基吲哚引入天然产物鬼臼毒素中合成的全新化合物，4β-( 5-甲氧基吲哚3-草酰氨基) -4-脱氧表鬼臼毒素( Fig 1)，具有微管蛋白的抑制剂活性。

本实验中，MTT法结果显示CCP-1对多种肿瘤细胞敏感，与抗癌药物依托泊苷相比，其抗肿瘤活性更强，显示了其高效低毒，抗癌谱广等优点，并对耐药细胞也有明显的抑制活性。本研究通过流式细胞术观察发现CCP-1可使细胞出现明显凋亡现象，由此推断CCP-1可能通过凋亡途径来发挥抗肿瘤作用。经典的MDR主要与一种相对分子质量为170 ku的跨膜糖蛋白( P-gp)有关［7－8］。分子水平研究显示: CCP-1可使KBv200细胞中mdr-1基因mRNA水平下降，免疫细胞化学法显示了相同的作用，不同浓度的CCP-1均可使KBv200细胞P-gp蛋白的表达量降低。由此提示CCP-1诱导多药耐药细胞凋亡，可能通过降低p-gp高表达细胞株上p-gp的表达，从而增加多药耐药细胞对抗癌药物的敏感性。含有微管蛋白的结构，如微管等，对有丝分裂过程中纺锤体的形成非常重要，在细胞生长、分裂以及细胞骨架组成中扮演关键角色。免疫荧光法检测显示CCP-1能够促进微管聚合、抑制微管解聚，这可能是其引起细胞凋亡的一个重要原因。动物移植肿瘤模型试验发现，CCP-1对小鼠实体肉瘤S180的生长抑制作用强于VP-16且毒性更小。

综上所述，CCP-1抗肿瘤多药耐药作用机制可以归结为下调mdr-1基因的表达，从而减少P-gp蛋白表达量，逆转其多药耐药表型，同时作用于微管蛋白促进微管聚合，进而诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡。CCP-1较本实验室先前合成的鬼臼毒素衍生物YB-L1EPO、YB-1EPN等有更强的抗肿瘤活性及抗多药耐药性，且毒性更小，有望成为新型高效的多靶点抗肿瘤药物。

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作者简介:张元( 1982－)，男，硕士，住院医师，研究方向:肿瘤药理学，E-mail: 306064053@ qq．com;

基金项目:国家自然科学基金资助项目( No 30873363) ;武警后勤学院博士启动金( No WHTD201304-2)

收稿日期:2015－09－07，修回日期: 2015－11－13

文献标志码:A A

文章编号:1001－1978( 2016) 01－0144－02 1001－1978( 2016) 01－0144－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030 10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030