靶向哺乳动物细胞线粒体的核酸转运

付爱玲

(西南大学药学院，重庆　400716)



靶向哺乳动物细胞线粒体的核酸转运

付爱玲

(西南大学药学院，重庆400716)

中国图书分类号: R-05; R329. 24; R342. 2; R342. 3; R589. 9; R977. 6

摘要:线粒体DNA( mitochondrial DNA，mtDNA)的遗传性突变和缺陷是多种线粒体功能失调相关疾病的根本原因。靶向线粒体递送核酸，可从根本上纠正mtDNA突变、挽救mtDNA损伤、阻断疾病进程。哺乳细胞内线粒体的核酸转运途径与细胞核的基因转染大不相同。该文综述了向哺乳动物细胞线粒体递送DNA和RNA( tRNA、rRNA、mRNA和反义RNA)的有效策略，并对其存在问题和发展趋势做一阐述。

关键词:线粒体转导;靶向序列;核酸转运;线粒体相关疾病; tRNA载体; 5s rRNA转导;穿梭蛋白

线粒体是哺乳动物中唯一具有核外DNA的细胞器，它保留着自身完整的一套遗传系统，为氧化磷酸化相关复合物的生成提供必需的多肽和蛋白质。哺乳动物线粒体DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA)长度为16．5 kbp，共编码13个与氧化磷酸化有关的多肽和蛋白质、22个tRNA和2个rRNA，不包含基因间隔区和内含子［1］。

哺乳动物mtDNA突变显然对宿主细胞有明显的不良影响，并且大量的事实已证明线粒体基因组突变是引发多种疾病的主要原因［2］:在人类mtDNA中，已确定超过300个突变与疾病的发生有关( http: / /www．mitomap．org)，如神经和肌肉退行性病变、心肌疾病、肿瘤、糖尿病和病理性衰老等［3］。常见的突变包括编码蛋白的基因反义突变、tRNA和rRNA基因点突变、基因复制或删除等等［4］。一般认为，当野生型和突变的mtDNA的比例达到一定的阈值时，就会出现临床症状［5］。

靶向线粒体基因组的核酸转运是治疗线粒体疾病的一个有效方法。线粒体进行DNA转染的主要困难是它的双层膜、体积小、数量大。为避开线粒体转染的难题，人们曾尝试间接蛋白质转导这一替代方法:通过质粒或病毒转染细胞，使细胞核表达由于mtDNA致病突变而缺乏的蛋白质，再经线粒体靶向序列将表达的蛋白质运输到线粒体［6］。尽管这一间接方法可能会得到令人鼓舞的结果，向线粒体递送核酸可从根本上纠正mtDNA突变、挽救mtDNA损伤、阻断疾病进程。已建立的方法主要有线粒体转导、载体介导、靶向肽或靶向序列引导、穿梭蛋白介导核酸进入细胞线粒体;此外，将外源RNA插入rRNA或tRNA中，根据线粒体对胞质内RNA的摄取作用，可将外源的RNA转运至线粒体内( Fig 1)。向线粒体内转运核酸仍处于当今研究的前沿。

Fig 1 Strategies of delivery of nucleic acid into mammalian mitochondria．Nucleic acids are transported mainly by exogenous mitochondria，carrier，targeted-peptides or sequences，and shuttle protein．Also，rRNA and tRNA can be used as carriers for delivering exogenous nucleic acids into mitochondria．

1　向细胞内递送mtDNA

1．1整个线粒体转导在正常状态下，哺乳动物和植物细胞的线粒体极少从胞质中直接摄取DNA，因此常规的细胞转染方法不能使DNA进入线粒体。而单细胞生物酵母和莱茵衣藻不同，它们的线粒体可从胞质中摄取少量的DNA。

在早期的研究中，Clark等［7］将分离的线粒体( mtDNA中含有抗生素耐受性序列)与哺乳细胞共孵育，得到了抗生素耐受性的细胞，表明分离纯化的线粒体可直接被细胞内吞，并在胞质中发挥作用，从而使原本对抗生素敏感的细胞对抗生素产生了耐受性。然而，在以后的25年内，一直没有人关注这个发现。直至Katrangi等［8］报道了将分离的正常线粒体与去除线粒体的人A549肺癌细胞一起孵育，正常线粒体被细胞所摄取，从而恢复了细胞的呼吸链。在最近的报道中，为提高线粒体进入细胞的效率，将细胞穿透肽Pep-1连接到分离的野生型线粒体(活力约为83. 5%)表面，加入到肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维综合症病人的细胞中，结果显示在给予线粒体3 d后，细胞的线粒体功能得到了恢复，包括恢复了氧化磷酸化亚单位(复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ)的活性、线粒体膜电位和ATP的生成量，同时降低了活性氧自由基的产生［9］。

此外，将外源线粒体显微注射到细胞内，可导致外源线粒体快速取代细胞自身的线粒体。这个方法可用于改善受精卵线粒体功能的研究。由于哺乳动物的受精卵线粒体来源于母系，母系线粒体中的遗传突变将传递给下一代，因此线粒体替代的方法可能会对母系遗传疾病有一定的治疗作用。研究表明，将分离的线粒体显微注射到小鼠受精卵中，在胚胎发育的第一阶段可检测到外源线粒体和mtDNA［10－11］，然而，随后其水平大幅下降，其机制尚不清楚。

1．2重组DNA的线粒体转导在验证外源线粒体替代的同时，研究还发现了线性DNA可直接进入分离的线粒体。在缺乏任何人工手段下，线状的裸DNA可主动进入分离的植物、动物和真菌线粒体中［12］。此外，外源DNA进入线粒体后，可进行转录和表达，并且一些损伤的DNA在进入植物和动物线粒体后也可被修复。已知细胞核基因组在细胞DNA转染时，对DNA的序列和长度有所限制，但分离的人线粒体对线性DNA的长度和序列无选择性。

环状DNA(质粒)可通过电穿孔的方式进入线粒体。在生理条件下，电穿孔可引发哺乳动物、原生生物或植物中分离的线粒体对DNA的摄取。Yoon等［13］将来源于大肠杆菌的DNA中增加了一个转导起始区( origin of transfer，oriT)序列，然后将其转染入分离的线粒体，当把线粒体与活细胞孵育后，重组的DNA可在活细胞的线粒体内进行表达。

此外，有人在无复制性的大肠杆菌中构建哺乳动物的全部mtDNA，将这种含有mtDNA的大肠杆菌介导至体外培养的哺乳动物细胞质中，使克隆的mtDNA与细胞本身的线粒体mtDNA对接。这种由大肠杆菌介导的mtDNA重组的方法也能得到设计的mtDNA［14］。

1．3线粒体靶向序列引导DNA进入向线粒体与整个线粒体转导的研究相反，通过线粒体靶向序列或靶向肽将DNA转运进入线粒体，这些研究开展较早、进展较快，并仍在持续进行。

已知由细胞核指导的线粒体前体蛋白在合成后，在N末端带有线粒体靶向序列。该序列通过线粒体的蛋白导入途径，引导蛋白质进入线粒体。常用的线粒体靶向序列有细胞色素氧化酶亚基8前体蛋白N末端的23个氨基酸( MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPR)等［15］。线粒体靶向序列也可引导其他分子(核酸、纳米颗粒、脂质体)等进入线粒体。

将线粒体靶向肽的N末端与17个或322个碱基对的DNA回文序列连接，连接物也可进入分离的大鼠肝线粒体中。在另外的体系中，线粒体靶向肽与肽核酸的一个片段连接，复合物可进入分离的哺乳动物细胞线粒体中。近期研究表明，线粒体靶向肽与结合DNA的PEI偶联，多肽/PEI/ DNA复合物可定位在活细胞的线粒体［16］。然而，该方法存在的问题是DNA与多肽的连接物不易合成，且易于水解，此外，线粒体靶向序列引导其他物质虽然可进入线粒体，但可能难以通透细胞膜，因此，需其他有效的途径弥补这个方法的缺陷。

为解决线粒体靶向序列与DNA的连接物可能难以进入细胞的问题，进一步开发了“转导载体”复合物。该复合物包含了细胞穿透肽［17－18］、线粒体靶向肽和线粒体转录因子A( TFAM)或mtDNA结合因子。其中后者可与DNA非共价结合，细胞穿透肽引导复合物进入细胞。而线粒体靶向肽引导复合物进入线粒体。这个复合物曾用于向帕金森病模型细胞的线粒体运送DNA，结果表明转导载体和DNA的共定位于线粒体，并阻断了线粒体损伤［19］。此外，使用转导载体将正常的mtDNA运输进含有突变mtDNA的人类细胞，线粒体的功能可部分恢复。如果通过转导载体将致病的mtDNA介导入人神经祖细胞，外源致病的mtDNA也可在线粒体中表达。

1．4纳米载体介导DNA进入线粒体设计的非阳离子脂质体载体MITO-porter能够用于向线粒体输送DNA［20］。MITO-porter是一个内核含有运输的药物，外层分别为线粒体融合层和内吞体融合层的纳米颗粒。MITO-porter经内吞进入细胞后，外层分别通过与内吞体膜和线粒体膜融合，以膜融合的方式携带药物进入活细胞线粒体基质中［21］。

有些双性载体也能够通过线粒体膜并聚集在线粒体内(如三苯基膦)，这些载体可用于向线粒体内转运DNA。双性载体可通透脂质双层膜进入线粒体中。将PNA寡聚体与之共价连接后，在膜电势驱动下，双性载体将PNA携带进入培养的人细胞的线粒体。此外，丝氨酸衍生的双性表面活性剂/DNA复合物也可经内吞机制进入细胞后，转染50%以上细胞的线粒体［22］。

2　输送tRNA进入线粒体

尽管正常细胞的线粒体很少从胞质中摄取DNA，但在大多数物种中，线粒体可天然地从胞质中摄取RNAs，其中最常见的是tRNA。这是由于线粒体的基因组并不编码完整的一套tRNA，因此线粒体就需分享胞质翻译系统中核编码的tRNAs。不同物种能够转导进线粒体的tRNAs数量不同，例如有袋动物的线粒体仅可转导进一个tRNAs，而锥虫线粒体可转导进所有tRNAs［23］。tRNAs进入线粒体的机制极可能是非特异tRNA导入复合体( tRNA import complex，RIC)途径。

2．1细胞核异位表达治疗线粒体疾病的tRNAs人类有些线粒体疾病是由于编码tRNA基因的mtDNA发生了突变，因此由细胞核编码并从胞质内补充功能性的tRNA，可能会有效抑制mtDNA的无义突变。以往以为，人类细胞的线粒体可编码自身所有的tRNA，直至在体外实验发现它们还可摄取酵母胞质的tRNAslys( CUU)及其变异体，随后实验也证明了人类线粒体可天然摄取胞质的tRNAGln，表明了人类线粒体至少也保持了摄取tRNAs的能力。

肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维综合症的主要病因是人成纤维细胞中mtDNA编码Lys的tRNA基因发生了点突变。将来源于酿酒酵母的tRNAslys衍生物转导进入tRNAlys8344 A＞G突变的人成纤维细胞的线粒体［24］，当该异源的tRNAslys转导进入线粒体后，可参与线粒体内翻译，部分纠正了由于mtDNA突变引起的功能性损伤。相似的方法也用于纠正线粒体tRNAleu3243 A＞G突变引起的另一个恶性疾病——线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征［25］。

2．2设计的tRNA作为载体向线粒体转运核酸线粒体对天然tRNAs的摄取激发了tRNA是否可作为靶向载体的研究。已知锥虫的所有线粒体均可从胞质中摄取tRNAs(包括tRNATyr前体)，而tRNA前体包含了11个核苷酸的内含子，因此将此内含子用合成的外源38个核苷酸的序列取代，得到的tRNATyr变异体可转导进入转基因的利士曼原虫( leishmania tarentolae)线粒体中。这个结果提示，天然tRNA的变异体可作为载体，包埋在tRNA的小RNA随之进入人类细胞，从而抑制突变mtDNA的翻译。

3　向线粒体内递送反义RNA

使用MITO-Porter系统，将针对细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(线粒体呼吸链的组分之一)的反义RNA寡核苷酸( antisense RNA oligonucleotide，ASO)转运到线粒体。在线粒体内，ASO选择性敲除了细胞色素C氧化酶亚基II的mRNA和蛋白，同时ASO通过下调呼吸链，线粒体膜电位去极化。这是首次报道的纳米载体介导反义RNA靶向线粒体基因组，从而调节线粒体功能［26］。

热带利什曼原虫寄生原虫中的RIC是辅助tRNA进入线粒体的必需载体。最近采用该RIC为载体，快速并有效地将反义RNA或DNA转导进入培养的人细胞线粒体中，结果显示反义RNA可特异性诱导靶向的线粒体mRNA降解并影响下游的呼吸作用，说明RIC可用于向完整细胞的细胞器中靶向递送治疗性的RNA［27］。

4　rRNA作为核酸载体

5s rRNA是所有活细胞生物核糖体的基本组成成分，但线粒体基因组中并不包含5s rRNA基因，因此大量核编码的5s rRNA可天然从胞质进入线粒体，避开传统的核仁导入途径。其中线粒体的5s rRNA导入因子硫氰酸酶和线粒体核糖体蛋白L18可能起重要作用［28］。在线粒体中，5s rRNA与核糖体相互作用，并对线粒体的蛋白质翻译有重要作用。

以5s rRNA为载体，使其携带针对mtDNA目的序列的互补DNA寡核苷酸，可对mtDNA进行荧光杂交。其中使用可与DNA结合的Alexa Fluor® 488或647荧光染料作为寡核苷酸标记探针。探针在5s rRNA载体的作用下，进入到HepG2细胞的线粒体基质中，与互补的mtDNA序列结合［29］。

在分析人5s rRNA被线粒体摄取的机制时，发现去掉β区并不影响其摄取，因此考虑使用人工设计的序列取代这个区域。例如，用13个核苷酸外源序列取代这个区域，衍生的5s rRNA变异体可进入人类细胞线粒体中。此外，该方法可将反基因组的寡核苷酸靶向性运送入线粒体，阻断人类细胞中带病理突变mtDNA的复制。这个方法还可将突变mtDNA的拷贝数降低到产生疾病的阈值以下。

5　穿梭蛋白输送mRNA进入线粒体

人们曾研究使用穿梭蛋白携带RNA靶向进入线粒体，其中氨基酰化tRNA合成酶已用于线粒体tRNA的输入。但这种特异的RNA结合蛋白转运tRNA转进入线粒体的效率较低。在哺乳动物细胞中，存在一种RNA结合蛋白——二氢叶酸还原酶( dihydrofolate reductase，DHFR)［30］。哺乳动物的DHFR可在体内天然结合自身的底物mRNA，若与线粒体靶向序列连接后，可实现对RNA的转运。在分离的植物线粒体，DHFR可通过共转运的方式高效地将tRNA和长片段RNA转运进线粒体，包括延长的tRNA前体或全长的线粒体mRNA(不含任何tRNA成分)。此外，两个不同的全长mRNAs也可由DHFR转运到分离的哺乳动物线粒体。该方法可成为向植物和哺乳动物线粒体内高效转运长片段RNAs的方法。

6　结语与展望

向线粒体内补充核酸是治疗线粒体疾病的清晰途径。采用线粒体靶向序列、纳米载体或脂质体可将DNA转导到线粒体中，并且由于线粒体使用的是非通用遗传密码，DNA中的密码子只要能够被线粒体核糖体阅读，就能够进行转录和翻译。但外源DNA与mtDNA的重组部位和机制尚需进一步阐明。

除了DNA转染外，RNA转运也将对线粒体遗传学带来重大进展。由于哺乳动物线粒体在进化过程中仍保留了对RNAs摄取的能力，可通过直接转运tRNAs或5s rRNA，以补充线粒体中相关RNA的缺失而治疗疾病。此外，将RNAs前体中的内含子用小片段RNA替代，RNAs前体进入线粒体后，小片段RNA被剪切并释放出来，用于纠正DNA突变。同时，全长mRNA的线粒体转运也可在穿梭蛋白的协助下进行。总之，完善和发展线粒体核酸治疗技术，可纠正线粒体遗传缺陷和损伤，最终实现对线粒体疾病的治疗。

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Targeting delivery nucleic acid into mammalian mitochondria

FU Ai-ling
( College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400716，China)

Abstract:Mitochondrial DNA ( mtDNA) genome mutations and defects are the essential mechanism of a various of mitochondrial dysfunction associated with diseases．The studies of targeting delivery nucleic acid into mammalian mitochondria can thoroughly correct mtDNA mutation，rescue mtDNA impairment and then reverse the progress of diseases．There’s obvious differences between nucleic acid import pathway of mammalian mitochondria and gene transfection of nuclei．In this paper，the effective strategies of delivering DNA and RNA( tRNA，rRNA，mRNA and antisense RNA) into mitochondria have been reviewed，as well as the challenges and development．

Key words:mitochondrial transduction; targeting sequence; nucleic acid transfer; mitochondria-associated diseases; tRNA carrier; 5s rRNA transduction; shuttle protein

作者简介:付爱玲( 1973－)，女，博士，教授，研究方向:神经药理学、生物化学和分子生物学，Tel/Fax: 023-68251225，E-mail: fuailing1008@ hotmail．com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( No 81273416) ;教育部高校基本科研业务费( No XDJK2013A030) ;教育部回国人员启动基金;教育部新世纪优秀人才支持计划资助

收稿日期:2015－10－05，修回日期: 2015－11－26

文献标志码:A

文章编号:1001－1978( 2016) 01－0001－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．001