BRAF激酶抑制剂的研究进展

许常旭　陈莉　査晓明

摘要：MAPK信号转导通路能调控细胞的生长、增殖和分化，尤其在多种肿瘤细胞中异常活跃。BRAF激酶是Raf家族在MAPK信号通路中最重要的亚型，其过多表达或突变与肿瘤的发生密切相关，同时它的易激活、易突变和基础酶活高等特点使其成为抗肿瘤药物研发的热门靶标。因此，基于BRAF靶标的抗肿瘤抑制剂日益受到研究者的关注。本文对近来年国内外研究的BRAF抑制剂作一综述

关键词：BRAF激酶；BRAF抑制剂；抗肿瘤

促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）是人体内最重要的信号转导通路之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。Raf是MAPK通路中重要的信号转导因子，承接上游Ras信号，传递给下游MEK/ERK，影响着细胞的生长和分化。BRAF作为Raf家族在MAPK信号通路中最重要的亚型，其过量表达或突变都可能诱发肿瘤的发生和发展[1]。因此基于BRAF靶标的BRAF抑制剂已成为抗肿瘤药物研发的热点。本文就近几年国内外对BRAF抑制剂在抗肿瘤方面的研究进展作一综述。

1 BRAF激酶及活性调节

BRAF激酶包含3个保守区域，分别是RAS结合域、富含丝氨酸/苏氨酸结构域和催化结构域。它的催化活性中心包括铰链区（hinge region， hinge）、磷酸环 （phosphate-binding loop， P-loop）、αC螺旋（αC helix） 以及活化环（activation loop， A-loop），并且与ATP结合位点有部分重合。同时，它存在活性（Type I）和非活性（Type II）两种构象。当处于Type I状态时，A-loop处于打开状态，但当A-loop起点的三个保守氨基酸（Asp594-Phe595-Gly596）组成的DFG基序围绕Asp594向αC helix方向旋转8A，出现一个疏水结合区（也称为变构结合位点），则转变成Type II构象。正常情况下，BRAF依靠P-loop与A-loop之间的疏水作用而维持着Type II构象，但当活化的Ras将BRAF招募至细胞膜时，A-loop上的Ser599和Thr602发生磷酸化，破坏了两者的稳定作用，DFG基序发生旋转，BRAF转变为Type I构象[2]。

BRAF在7～8%的肿瘤细胞中存在突变，其中90%是braf基因外显子15的第1799位核苷酸T突变为A，导致其编码的600位缬氨酸被谷氨酸取代，即BRAFV600E。BRAFV600E突变模拟了野生BRAF S599/T602（BRAFWT）的磷酸化，破坏P-loop和A-loop之间的疏水作用，使BRAF在没有上游Ras激活的作用下仍然处于异常激活状态。这种突变使得BRAFV600E的激酶活性是BRAFWT的500倍，能持续性激活MEK/ERK信号通路，促进了肿瘤细胞增殖、分化和侵袭转移。

2 BRAF抑制剂

目前，根据抑制剂与激酶的不同构象相互作用，可将BRAF抑制剂也可分为I型抑制剂和II型抑制剂。

2.1 I型抑制剂 型抑制剂结合BRAF的Type I构象，是ATP竞争性抑制剂。它主要通过模拟ATP的腺嘌呤环与铰链区形成氢键作用，锚定在激酶片层间，伸展开来的疏水基团占据ATP结合位点，而起到抑制激酶活性的效果。目前已成功上市的I型抑制剂是Vemurafenib （PLX4032）和Dabrafenib （GSK-2118436）。

2.1.1 Vemurafenib （PLX4032，1）

Vemurafenib是一种新型的特异性BRAFV600E口服抑制剂，于2011年8月被FDA批准用于治疗BRAFV600E突变的晚期转移性或不能切除的黑色素瘤。该药物是片段药物设计原理的经典案例：Plexxikon公司对200万个小分子进行激酶抑制率初筛、共晶分析得到一个广谱的激酶抑制剂母核--7-氮杂吲哚（7-azaindole，2）；再通过计算机辅助设计、化学结构改造得到特异性BRAFV600E抑制剂先导物--PLX4720（3）；最后为改善药代动力学性质在母核5位插入一个苯环得到Vemurafenib[3]。

Vemurafenib作为首个治疗黑色素瘤的个体化靶向药物，疗效迅速，治疗反应率良好；但靶标的专一性使其对机体的代偿作用和信号旁路无效，黑色素瘤患者常在Vemurafenib治疗8～9月后出现耐药性问题。目前，这种耐药性有望通过联合用药得到解决，GSK与Roche正在合作进行Vemurafenib的靶向疗法联合易普利姆玛（Ipilimumab）的免疫疗法来治疗晚期黑色素瘤的临床试验[4]。

Steve等[5]根据生物电子等排原理改造Vemurafenib得到磺酰胺类BRAF激酶抑制剂4和5，其抑制BRAF的IC50分别为38和4.8nM。后续进一步结构改造得到酶（IC50=0.3nM）和细胞（IC50=6nM）抑制活性更佳的化合物6，且动物实验表明6药代动力学性质较好，口服有效[6]。

2.1.2 Dabrafenib （GSK-2118436，7）

Dabrafenib是GSK公司开发的另一个新型口服靶向Type I BRAF抑制剂，已于2013年5月获FDA批准用于治疗不可切除的或转移性黑色素瘤[7]。临床发现，它与Vemurafenib类似，在治疗6～7个月后出现耐药性问题。为了克服耐药性，GSK和日本Tobacco公司合作开发Dabrafenib和MEK抑制剂Trametinib的复方制剂，并于2014年1月上市用于治疗BRAFV600E突变的黑色素瘤[8]。

2.1.3三芳基咪唑类化合物 三芳基咪唑类抑制剂是靶向激酶Type I构象的经典I型抑制剂，它包括一个N杂环，通常是吡啶或者嘧啶，常与铰链区Gln530或Cys532发生氢键作用；中心的咪唑环占据ATP结合口袋，环C取代芳基与变构位点相互作用，芳香环D引入极性基团伸向溶剂区（见图1），代表化合物SB-590885（8）。据报道，化合物8对BRAF的Kd值为0.3 nM，可见其酶抑制活性非常高[9]。

图1 三芳基咪唑类BRAF抑制剂及与BRAF结合模式

Dan等[10]对8进行改造，将C环的肟改成带氢键供体的吡唑，设计出化合物9，并以9为先导物进一步结构优化，将D环取代基环合成甲基哌嗪得到活性更加的10，其抑制BRAFV600E的IC50为240 nM。2013年，Dan[11]等又将C环换成萘酚得到脂溶性和活性更佳的化合物11（抑制BRAF的IC50=9nM）。

2.1.4噻吩类化合物 Xie等[12]利用分子对接和结构虚拟筛选（SBVS）技术成功从SPECS数据库中筛选到一系列噻吩类BRAFV600E选择性抑制剂，其中化合物12和13抑制BRAFV600E的IC50达到微摩尔级，可作为先导物来进一步改造。

2.2 II型抑制剂 II型抑制剂与BRAF的Type II构象结合，通过2～5个氢键占据疏水口袋中的变构位点。其中最重要的两个氢键分别是与αC-helix中保守的Glu侧链形成的氢键和与DFG基序中Asp形成的氢键。而这个疏水口袋周围的氨基酸保守性较差，因此II型抑制剂可能具有更好的选择性。

2.2.1 Sorafenib （BAY 43-9006，14）

Sorafenib是首个成功上市的Raf激酶抑制剂，尽管后续研究发现其体内抗肿瘤活性主要是通过多种受体酪氨酸激酶（RTK），包括VEGFR、PDGFR和kit等抑制肿瘤组织内新生血管的生成；但它作为第一个BRAF抑制剂，临床前研究表明，它对BRAFWT和BRAFV600E都有很好的激酶抑制活性。蛋白晶体复合物揭示，Sorafenib与激酶Type II结合，属于II型抑制剂，它的吡啶环上酰胺基与铰链区Cys531形成氢键促使吡啶环占据ATP结合口袋；脲基片段与Glu500和Asp593形成三个氢键，稳定住BRAF的非活性构象；末端的三氟甲基占据αC helix和DFG基序的末端N残基构成的疏水口袋。通过上述结合作用Sorafenib使BRAF激酶不能磷酸化，从而抑制激酶活性。基于Sorafenib结构柔性较大，后续研究者采用骨架跃迁来降低分子的柔性。

2.2.2 RAF265（17） Savithri等[13]将Sorafenib的脲基分别与A、B芳环拼合得到化合物15和16，虽然两者的BRAF抑制活性略有下降，但理化性质和药代动力学性质都有所提高。因此，以16为先导物进一步结构优化得到活性较好的RAF265（17）。在人类移植瘤研究中，RAF265对BRAFV600E人移植瘤和BRAFWT模型都具有高效性，目前正处于治疗转移性黑色素瘤的二期临床实验阶段。

2.2.3吡啶并咪唑酮类化合物 Niculescu-Duvaz等[14]将Sorafenib末端酰胺与C环吡啶骈合成吡啶并咪唑酮，并在A环中去除4-Cl，加上6-甲氧基得到化合物18。初步活性评价结果表明，化合物18抑制BRAF激酶的IC50达到12nM，抑制黑色素瘤生长的 IC50为4.2 μmol·L-1。进一步结构优化将B环换成萘环以占据ATP结合位点旁的亲脂性口袋，最后得到酶（IC50=6nM）和细胞（IC50=0.32μmol·L-1）抑制活性都更佳的化合物19。

2.2.4噻吩并吡啶类化合物 Tang等[15]用4-氨基噻吩并吡啶替换C环得到化合物20和21，活性筛选显示其抑制BRAF的IC50分别为9.6和5.1nM，抑制黑色素瘤的 IC50为0.7和0.2μmol·L-1。

3结论

BRAF抑制剂能靶向性抑制MAPK信号通路中的BRAF激酶，上市药物有Sorafenib、Vemurafenib和Dabrafenib，临床用于黑色素瘤的治疗。但这些药物仍面临诸多挑战，例如Sorafenib存在靶点特异性不强，BRAF的基因突变造成Vemurafenib和Dabrafenib临床中都出现耐药性，因而迫切需要开发新型特异性耐突变BRAF特别是BRAFV600E抑制剂。借助于BRAF三维晶体结构的解析和计算机虚拟筛选技术的进步，将会有越来越多结构新颖、特异性强、耐突变的BRAF抑制剂被研究开发出来，用于黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌等肿瘤疾病治疗。

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编辑/申磊