抗衰片对电离辐射损伤后小鼠骨髓造血作用的影响

康肖梦，王华伟，杜利清，赵洁，张宇睿，王华南，杨福军，徐文清



抗衰片对电离辐射损伤后小鼠骨髓造血作用的影响

康肖梦，王华伟，杜利清，赵洁，张宇睿，王华南，杨福军Δ，徐文清Δ

摘要：目的探讨抗衰片对电离辐射损伤后小鼠造血重建的调控影响。方法9～10周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为照射对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。后3个剂量组分别按0.75、1.5、3.0 g/kg体质量灌服抗衰片水溶液，照射对照组给予同体积生理盐水，1次/d，连续给药11 d。第4天对4组小鼠进行6.0 Gy137Cs-γ射线单次全身照射。照射后第8天，观察小鼠内源性脾结节（即脾集落形成单位，CFU-S）、小鼠骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）的生成情况。同时，体外扩增的骨髓间充质干细胞（MSC）与正常供体小鼠的造血干细胞（HSC）进行二维共培养（2D CFU-GM），通过2D CFU-GM检测辐射损伤后药物作用的MSC促进HSC的增殖能力。结果与照射对照组相比，3个剂量组的CFU-GM数目显著增多，中剂量组及高剂量组CFU-S、CFU-F、2D CFU-GM增殖能力显著提高（均P＜0.05）。结论抗衰片可以促进电离辐射损伤后小鼠造血系统重建。

关键词：抗衰片；辐射损伤；造血重建；间质干细胞；造血干细胞

电离辐射可对机体造成一系列严重损伤，包括免疫系统、造血系统、消化系统等，其中以骨髓造血系统最为敏感[1]。辐射损伤后造血系统功能恢复在辐射损伤的救治中处于核心地位。因此，寻找调控造血恢复的有效手段以提高辐射损伤的救治效果，对辐射损伤或意外照射患者的救治十分重要。

中医认为，射线是“火热毒邪”，作用人体会导致热毒过盛、津液受损，进而灼津烁血、伤阴耗气，导致气血损伤、脾胃失调、肝肾亏损等。因此，应该以清热解毒、养阴生津、健脾和胃、滋补肝肾等作为辐射损伤的治疗原则。中药复方抗衰片具有健脾益肾、涤痰降浊、活血散结的功效。此方中丹参活血通络；桑寄生、淫羊藿、何首乌、杜仲调补肝肾、益精填髓；茯苓、菖蒲祛痰开窍；龟甲益肾强骨、养血补心；党参补中益气、健脾益肺[2-3]。全方可调和阴阳，扶正祛邪，填精补髓，强身健脑。因此，本研究以抗衰片作为药物干预手段，探讨辐射损伤后通过改善造血微环境，进而调控造血重建作用，为临床辐射损伤的救治尤其是放疗后造血系统损伤的恢复提供借鉴作用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器实验动物：SPF级9～10周龄雄性C57BL/6小鼠40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物实验中心饲养，温度（23±1）℃，相对湿度55%±5%，压力差≤10 Pa，每日光照12h，自由摄食饮水。主要材料：生理盐水（0.9%氯化钠注射液；中国大冢制药有限公司）；MesenCult®MSC Basalmedium（Mouse；STEMCELL TECHNOLOGIES公司，产品号：05501）；MesenCult®MSC Stimulatory Supplements（Mouse；STEMCELL公司，产品号：05502）；DMEM培养基（Gibco公司）；IMDM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，HyClone公司）；甲基纤维素半固体培养基（STEMCELL公司）；胰蛋白酶（Invitrogen公司）。主要仪器：超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）；CO2培养箱（NAP⁃ COmODEL 5410）；倒置显微镜（OLYMPUS IM）；137Cs-γ射线照射源（加拿大原子能有限公司，Gammacel 40）。

1.2实验方法

1.2.1动物分组与给药将40只小鼠按照随机数字表法分为照射对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。3个给药组分别按0.75、1.5、3.0 g/kg灌服抗衰片水溶液，照射对照组给予同体积生理盐水，1次/d，连续灌胃11 d。第4天对4组小鼠进行6.0 Gy137Cs-γ射线单次全身照射，剂量率1 Gy/min。照后继续给药7 d。

1.2.2脾结节（即脾集落形成单位，CFU-S）计数照后第8天，处死小鼠。取脾脏，Bouin氏液固定，计数其表面突起的CFU-S。

1.2.3骨髓间充质干细胞（MSC）获得与培养无菌条件下，取小鼠双侧股骨和胫骨，剔除表面肌肉和结缔组织，用含2% FBS的IMDM冲出骨髓，制成单细胞悬液，计数，400×g离心1min，MSC培养基重悬细胞，于25 cm2培养瓶中37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内进行培养。

1.2.4骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）计数调整骨髓细胞浓度至5×104个/mL，将细胞液加入到甲基纤维素半固体培养基中，涡旋混匀后接种至12孔板中培养，每组设3个平行孔，第8～12天观察、计数。

1.2.5骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）计数用MSC培养基调整骨髓细胞浓度至5×106个/mL，接种至6孔板，每组设3个平行孔，第7～8天观察。

1.2.6MSC支持HSC增殖的二维共培养研究（2D CFUGM）取第2代MSC，调整细胞浓度至1.5×105个/mL，接种至6孔板。24h细胞贴壁后，吸去MSC培养基，每孔加入1× 105个/mL正常C57BL/6供体小鼠骨髓细胞，每组设3个平行孔，第10天左右观察。

1.3统计学方法应用SPSS 13.0软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1CFU-S检测结果与照射对照组和低剂量组相比，中、高剂量组的脾结节数目均显著升高（P＜0.05）。说明抗衰片对受照小鼠髓外造血功能有促进作用，见图1。

Fig.1　Effects of KS tablet on CFU-S ofmice treated with137Cs-γ ray图1　抗衰片对137Cs-γ射线损伤小鼠脾结节的影响

2.2CFU-GM检测结果与照射对照组相比，3个剂量组的CFU-GM增殖能力显著提高，且高剂量组的CFU-GM增殖能力显著高于低剂量组（P＜0.05）。说明抗衰片对受照小鼠HSC增殖能力的提高有促进作用，见图2。

Fig.2　Effects of KS tablet on CFU-GM in four groups图2　抗衰片对各组CFU-GM的影响

2.3CFU-F检测结果与照射对照组相比，中、高剂量组的CFU-F增殖能力均有显著提高，且中剂量组高于低、高剂量组（P＜0.05）。说明抗衰片对受照小鼠MSC具有促进作用，见图3。

Fig.3　Influence of KS tablet on CFU-F ofmSC in four groups图3　抗衰片对各组间充质干细胞CFU-F的影响

2.4MSC与HSC共培养2D CFU-GM的结果与照射对照组相比，中、高剂量组的2D CFU-GM增殖能力提高（P＜0.05）。3个剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

Fig.4　Influence of KS tablet onhSC functions supported bymSC （2D CFU-GM）图4　抗衰片对MSC支持HSC功能（2D CFU-GM）的影响

3　讨论

电离辐射会对机体的造血系统、免疫系统、消化系统等造成严重损伤，其中尤以骨髓造血系统最为敏感。射线对HSC产生杀伤同时，也对骨髓造血微环境造成损伤[4]。目前的研究多侧重于HSC的调控方面，而对HSC依赖的造血微环境研究较少。

正常造血功能依赖于造血干细胞与骨髓造血微环境之间的相互作用[5]。近年来越来越多的细胞和分子水平实验证实，造血干细胞在造血微环境各因素的调控下进行增殖、分化、发育和成熟。骨髓造血微环境主要由基质细胞、细胞外基质以及基质细胞所分泌的细胞因子构成。基质细胞包括血管内皮细胞、间充质干细胞、成骨细胞、巨噬细胞等多种非造血细胞。位于血管内皮附近的MSC作为造血微环境的重要组成之一[6]，一方面特异性分化为成骨细胞、脂肪细胞等基质细胞[7]，另一方面维持造血干细胞功能[8]。研究证实，MSC通过其表面的黏附分子以及分泌多种细胞因子来维持HSC功能，如干细胞因子（SCF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、白细胞介素（IL）等[9-10]。

本实验对接受亚致死剂量γ射线照射的小鼠给予具有健脾益肾、涤痰降浊、活血散结功效的中药复方抗衰片，以期达到调控造血微环境进而调控HSC功能之效。结果显示小鼠接受射线照射后，骨髓HSC及造血微环境均受损，脾脏出现结节状造血灶，即内源性脾结节（CFU-S）。脾结节反映了HSC的功能，代表机体造血功能恢复的能力[11]。本次实验研究发现，中、高剂量组小鼠脾结节数均高于照射对照组，提示抗衰片能够促进髓外脾脏造血功能，促进造血恢复。CFU-GM反映了HSC自我更新能力的大小。本次实验结果显示，3个剂量组的CFU-GM数目均显著大于照射对照组，说明抗衰片可以促进机体造血功能的恢复。骨髓MSC经体外培养可以形成CFU-F，而MSC为分泌造血因子的主要细胞成分，说明CFU-F在一定程度上可以间接反映机体造血微环境的情况[12-13]。本研究的中、高剂量组CFUF集落形成能力显著高于照射对照组，提示抗衰片能促进基质细胞MSC的增殖能力，对改善造血微环境起到一定的作用。上述实验结果并不能直接证实抗衰片是通过调控造血微环境的功能，从而调控HSC增殖的作用。为此本课题组进行了MSC与HSC体外共培养实验（2D CFU-GM）。实验结果表明，中、高剂量组2D CFU-GM增殖能力显著高于照射对照组，提示抗衰片可能是通过增强MSC功能从而改善造血微环境，进而促进HSC功能的恢复。

综上所述，抗衰片可以通过增强辐射损伤后造血微环境中基质细胞MSC功能，改善造血微环境，进而调控HSC功能，重建造血功能。其中，中剂量组效果比较显著。抗衰片调控造血微环境进而调控造血功能的具体作用机制目前尚未阐述清楚，因此后续研究需要进一步从分子水平进行探讨。

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（2015-09-02收稿2015-11-05修回）

（本文编辑李鹏）

The effects of KS tablet onhematopoietic regulation inmice treated with radiation

KANG Xiaomeng, WANGhuawei, DU Liqing, ZHAO Jie, ZHANG Yurui, WANGhua′nan, YANG FujunΔ, XU WenqingΔ
Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science & Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail：fjyang32@126.com; xuwenqing@irm-cams.ac.cn

Abstract：Objective To investigate the effects of Kangshuai (KS) tablet on thehematopoietic reconstitution inmice treated with radiation.Methods C57BL/6mice were randomly divided into four groups: irradiated control group, low-dosebook=60,ebook=65group (0.75 g/kg),middle-dose group (1.5 g/kg) andhigh-dose group (3.0 g/kg).There were tenmice for each group.Themice in three treated groups were given KS tablet suspension orally for three days before the treatment with irradiation, and the control group was given equal quantity of normal saline.All themice were underwent irradiation of 6.0 Gy137Cs-γ rays, and were continuously given drug suspension or saline for seven days.Themice were sacrificed on the eighth day after irradiation.Colony forming unit of spleen (CSF-S), granulocytemacrophage colony-forming unit (CFU-GM) and fibroblast colony-form⁃ing unit (CFU-F).The 2D CFU-GMhematopoietic stem cells (HSC) were co-cultured withmesenchymal stem cell (MSC).Re⁃sults Compared with the irradiated control group, numbers of CFU-GM were significantly increased in three treatment groups.The proliferations of CFU-S, CFU-F and 2D CFU-GM were significantly enhanced inmiddle andhigh dose groups (P＜0.05).Conclusion KS tablet can promotehematopoietic reconstitution inmice after irradiation damage.

Key words：BSKS tablet；radiation injuries；hematopoietic reconstitution；mesenchymal stem cells；hematopoietic stem cells

通讯作者ΔE-mail：fjyang32@126.com；xuwenqing@irm-cams.ac.cn

作者简介：康肖梦（1989），女，硕士在读，主要从事造血系统辐射损伤防治研究

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273005）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（14JCZDJC36400）；中国医学科学院放射医学研究所所基金（SF1528，SF1533，ST1552）

中图分类号：R285.5，R818.74

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150143

作者单位：北京协和医学院；中国医学科学院放射医学研究所（邮编300192）