当归补血汤对骨髓辐射损伤过程中NF-κB及bax、bcl-2表达的影响

当归补血汤对骨髓辐射损伤过程中NF-κB及bax、bcl-2表达的影响

王晓玲赵舒武王媛媛1王娟娟1汪涛

(天津中医药大学中西医结合学院，天津300193)

摘要〔〕目的观察当归补血汤对骨髓辐射损伤过程中核因子(NF)-κB及下游因子bax、bcl-2表达的影响。方法取原代培养7 d的骨髓基质细胞用137Cs-γ射线(4 Gy)照射，在照射后24 h用含不同剂量的当归补血汤载药血清干预24 h；小鼠同剂量γ射线照射后，灌胃给药同剂量的当归补血汤1 w，处死小鼠取骨髓。应用免疫荧光技术，real-time RT-PCR分别检测辐射损伤骨髓基质细胞模型和小鼠模型骨髓的NF-κB及下游因子bax、bcl-2的表达。结果辐射可激活NF-κB信号，启动MSC和骨髓细胞凋亡过程。经当归补血汤干预，MSC和骨髓细胞内可下调NF-κB基因的表达，但随着药物剂量加大下调趋势减缓(P<0.05)；当MSC和骨髓细胞内bcl-2/bax比值升高时，对促凋亡信号敏感性减弱，表现出抗凋亡的特点，细胞存活寿命延长(P<0.05)。结论当归补血汤可通过影响NF-κB的表达调节bcl-2/bax，减少骨髓内细胞凋亡，有利于辐射损伤后机体造血免疫机能的恢复。

关键词〔〕当归补血汤；辐射损伤；骨髓；凋亡

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81273892)；天津市高等学校科技发展基金计划项目(20100205)；天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题(11030)

通讯作者：汪涛(1961-)，女，教授，硕士生导师，主要从事干细胞生物学研究。

1天津中医药大学护理学院

第一作者：王晓玲(1976-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中药防治辐射损伤机制研究。

Effect of Danggui buxue decoction on NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of mouse bone marrow in the process of radiation damage

WANG Xiao-Ling, ZHAO Shu-Wu, WANG Yuan-Yuan,etal.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Danggui buxue decoction on inhibiting bone marrow from apoptosis.MethodsBone marrow stromal cells (BMSCs) from mice were primary cultured for 7 days and then radiated by 137Cs-gamma ray (4 Gy). After irradiation for 24 h, BMSCs were cultured in the different concentration serum containing drug of Danggui buxue decoction for 24 h. After radiated by the same dose of gamma ray, mice were given the same dose of Danggui buxue decoction by intragastric administration for one week, and then sacrificed and extracted bone marrow. NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of BMSCs and mice bone marrow radiated by gamma ray were detected separately by immunofluorescence technique and real-time fluorescence quantitative RT-PCR method.ResultsNF-kappa B signal activated by radiation could start the process of BMSCs and bone marrow cells apoptosis. BMSCs and bone marrow cells down regulated the expression of NF-kappa B after the intervention of Danggui buxue decoction; but with dose increasing, a downward trend was slowed (P<0.05). When the bcl-2/bax ratio increasing in BMSCs and bone marrow cells, the apoptotic signals sensitivity was decreased and cells showed the anti-apoptotic specialty and life extension(P<0.05).ConclusionsDanggui buxue decoction could affect the expression of NF-kappa B and then adjust the bcl-2/bax ratio in order to reduce cell apoptosis in bone marrow radiated by gamma ray, and furthermore is conducive to the recovery of hemopoiesis and immune function after radiation injury.

【Key words】Danggui buxue decoction; Radiation damage; Bone marrow; Apoptosis

骨髓功能障碍是辐射对人体造成的主要伤害之一，电离辐射不仅可损伤骨髓内增殖活跃的造血细胞，同时也可对骨髓造血微环境造成一定程度的伤害。骨髓基质细胞(MSC)是构成造血微环境的重要组成部分，主要包括成纤维细胞、巨噬细胞、网状细胞、内皮细胞及脂肪细胞等。辐射属于外感热毒邪毒，可直中脏腑、伤阴和致气血不足，其基本病机是气血两虚及血淤，故骨髓辐射损伤属于中医“虚劳”、“气血虚”病症。出自金元时代李东垣的《内外伤辨惑论》的当归补血汤是补益气血的代表方，具有补气生血之功效，主治劳倦内伤、气血虚弱诸症。现代药理学研究表明当归补血汤具有益气补血、滋补排毒、抗辐射的功效，但具体的作用机制尚未明确。本实验主要探讨当归补血汤对抗辐射致细胞凋亡的分子机制。

1材料与方法

1.1动物SD大鼠60只，体重(200±15)g；昆明种小鼠100只，体重(20±0.5)g，雌雄不限，均购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001。

1.2试剂DMEM/F12培养基(Gibco公司)、特级胎牛血清(Hyclon公司)、MTT(Sigma公司)；NF-κB、bax、bcl-2兔多克隆抗体(Santa cruz公司)、FITC标记山羊抗兔IgG二抗(Immunoreagents公司)；RNA提取纯化试剂盒、RT-qPCR专用反转录试剂盒、SYBR Green qRCP试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；当归，黄芪饮片(天津中新药业)。

1.3方法

1.3.1不同剂量的当归补血汤水煎剂及载药血清的制备依据当归补血汤用药量(36 g饮片·kg-1体重·d-1)及“人和动物体表面积折算法”计算出小鼠临床等效剂量为4.5 g/kg，3倍剂量为13.5 g/kg，5倍剂量为22.5 g/kg。将中药复方1剂按照当归与黄芪1∶5的量浸泡在蒸馏水中，每克中药加水6 ml，泡30 min。武火煮沸后，文火煎煮30 min，过滤后收集煎液，原渣每克加水4 ml，再煎煮40 min，过滤取煎液，两者混合，4℃保存备用。

将大鼠随机分成4组，其中三组灌胃相当于大鼠临床等效剂量、3倍剂量、5倍剂量的黄芪当归合煎液(药物用量计算依据同前)，每只6 ml/d，2次/d，连续给药4 d，第4天灌胃后禁食，次晨灌服1次，1 h后无菌条件下腹主动脉取血，分离血清，56℃灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，密封，-20℃冻存。对照血清的制备：每日灌胃同体积的水，血清制法同前。

1.3.2MSC培养、分组及干预无菌条件下取出小鼠双侧股骨，用DMEM/F12培养基冲出骨髓吹打成单细胞悬液，离心后将细胞沉淀用含10%FBS的培养基悬浮，接种于培养板内。24 h后换液，吸出悬浮细胞。此后每隔2 d换液1次。7 d后细胞贴壁生长并基本融合。此时将MSC 经137Cs-γ射线(4 Gy)照射5 min(空白对照组不照射)。照射24 h后，除空白对照组外其余细胞均用无血清培养基洗细胞2遍，加入不同剂量的当归补血汤载药血清进行干预，24 h后进行指标检测。细胞分组：①空白对照组：用含10%胎牛血清的培养基培养；②照射组：细胞照射后用含10%正常大鼠血清的培养基培养；③给药1组：细胞照射后用含10%等效剂量当归补血汤大鼠载药血清的培养基培养；④给药2组：细胞照射后用含10% 3倍剂量当归补血汤大鼠载药血清的培养基培养；⑤给药3组：细胞照射后用含10% 5倍剂量当归补血汤大鼠载药血清的培养基培养。

1.3.3照射小鼠模型的制作、分组及干预小鼠装入有机玻璃鼠盒内，经4 Gy137Cs-γ射线全身一次性照射5 min(正常组不进行照射)。照射后在无菌层流架内饲养，水、饲料、垫料均经高温高压消毒。将75只小鼠随机分为正常组、照射组(仅照射)、给药1组(照射后给等效剂量的当归补血汤)、给药2组(照射后给3倍剂量的当归补血汤)、给药3组(照射后给5倍剂量的当归补血汤)，每组15只。照射后给药各组每天定时灌胃当归补血汤0.5 ml/只，持续7 d，同样条件下正常组和照射组灌胃生理盐水，饲养1 w后进行指标检测。

1.3.4MTT法检测不同培养条件下MSC的存活率将MSC培养6 d后，用无血清培养基培养24 h使其同步化，按照实验分组进行干预，当归补血汤载药血清作用24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，继续孵育4 h，吸出培养基，加入DMSO150 μl，振荡10 min，在酶标仪上测定570 nm处光密度(OD)值。

1.3.5免疫荧光显微技术观察MSC损伤模型的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亚细胞定位将无水甲醇固定的MSC爬片，封闭，分别滴加NF-κB、bcl-2及bax一抗(1∶100)，4℃冰箱过夜，滴加FITC标记的二抗工作液(1∶200)，在湿暗盒内37℃孵育30 min，Hoechst33258工作液染核，漂洗，滴加封片剂封片，暗盒保存，荧光显微镜观察。

1.3.6real time RT-PCR检测辐射损伤的MSC和小鼠NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表达(1)MSC及小鼠骨髓总RNA提取：按照RNA提取纯化试剂盒说明书提供的方法提取总RNA，-80℃保存。(2)MSC及小鼠骨髓总RNA反转合成cDNA：按RT-qPCR反转录试剂盒说明书冰上操作，依次加入反应液，逆转录条件为：37℃ 15 min(反转录反应)；85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，4℃冷却。合成的cDNA 放在-20℃保存。(3)real-time PCR反应：以β-actin作内参照，其序列为(引物扩增长度154 bp)：上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′；NF-κB序列(引物扩增长度111 bp)：上游引物：5′-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3′；下游引物：5′-TGTTGACAGTGGTATTTCTGGTG-3′；bax序列(引物扩增长度137 bp)：上游引物：5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′；下游引物：5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′；bcl-2序列(引物扩增长度120 bp)：上游引物：5′-ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC-3′；下游引物：5′-GGTATGCACCCAGAGTGATGC-3′。PCR反应条件：预变性95℃ 30 s；95℃变性5 s，60℃复性30 s，40个循环；72℃继续延伸10 s。

1.4统计学处理采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1照射后24 h不同培养条件下MSC增殖情况当归补血汤载药血清可明显减少辐射损伤后MSC的凋亡(P<0.05)，但随着药物作用浓度增高抗凋亡作用减弱，等效剂量载药血清抗凋亡效果最佳(P<0.05)。见表1。

表1　照射后24 h不同培养条件对MSC存活的

与照射组相比：1)P<0.05，与空白对照组相比：2)P<0.05

2.2免疫荧光显微技术观察MSC辐射损伤后的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亚细胞定位在辐射损伤后24 h，NF-κB蛋白主要位于MSC细胞核周围的胞质内，呈绿色荧光。bcl-2蛋白主要位于MSC胞质内，凋亡的MSC表达程度较弱或不表达，呈较暗的绿色荧光。照射组只有少数细胞表达，荧光较暗，给药各组的表达程度强于照射组，荧光亮度较强。bax蛋白在MSC内表达部位及荧光色泽与bcl-2相同，但表达强度的寓意不同，凋亡的MSC表达程度较强。照射组表达细胞数量多，荧光亮度强，见图1。给药组表达的细胞数量和荧光亮度均弱于照射组。

2.3real-time RT-PCR检测辐射损伤的MSC和小鼠骨髓NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表达在照射24 h后，各实验组MSC NF-κB的表达相对于空白对照组均明显下降，给药各组下调幅度更大，但随着药物剂量加大，下调幅度减弱(P<0.05)；各给药组bcl-2/bax的比值相对于正常组均明显下降，与照射组相比下降幅度减小，随着药物剂量加大下调幅度增加(P<0.05)。见表2。

A:NF-κB的表达；B:bcl-2的表达；C:bax的表达；①照射组；②给药1组；③给药2组；④给药3组 图1　免疫荧光显微镜观察MSC中NF-κB、bcl-2、bax的表达

组别NF-κBbaxbcl-2正常组1±01)1±01)1±01)照射组0.9431±0.00032)1.8707±0.00042)0.7705±0.00032)给药1组0.5966±0.00061)2)1.2097±0.00041)2)0.6668±0.00061)2)给药2组0.5985±0.00071)2)1.1554±0.00061)2)0.5960±0.00031)2)给药3组0.6294±0.00121)2)1.2479±0.00041)2)0.6419±0.00041)2)

与照射组比较：1)P<0.05；与正常组比较：2)P<0.05；下表同

在照射1 w后，除给药1组变低之外，其余各组小鼠骨髓NF-κB的表达均明显增高，随着小鼠灌胃药物剂量加大，表达上调明显(P<0.05)；各给药组小鼠骨髓bcl-2/bax的比值相对于正常组明显上升，与照射组相比各给药组bcl-2/bax比值均上升，随着药物剂量加大，上升幅度增加(P<0.05)。见表3。

表3　照射1 w后各组骨髓NF-κB、bax及

3讨论

当归补血汤由黄芪、当归两味药以5∶1配伍而成，当归、黄芪中含有多种有效成分如当归多糖、黄芪多糖、阿魏酸、黄芪黄酮类及甲苷等，具有益气补血、滋补排毒、抗辐射的功效，可以保护因辐射损伤的造血免疫系统，但具体机制尚未明晰。

转录因子NF-κB为同源或异源亚基形成的二聚体，可与核内DNA上的κB序列或胞质中IκB家族成员结合。细胞在静息状态下，NF-κB与IκB结合成三聚体存在胞质中；当细胞受到如细胞因子、内毒素、病毒、活性氧自由基、钙离子载体、紫外线及射线等信号刺激时，IκB的亚单位发生磷酸化激活，泛素化后被蛋白水解酶降解，释放出的NF-κB发生核易位，特异性结合到基因上的κB位点，进而调控机体的免疫炎症反应、细胞增殖与凋亡功能〔1〕。NF-κB可通过对其下游基因如bcl-2、bax及CyclinD1的转录调控来实现对细胞的增殖分化、凋亡与细胞周期的控制〔2，3〕。本研究过程中发现激活NF-κB信号既能诱导抗凋亡基因的表达，也能诱导促凋亡基因的表达，抗凋亡还是促凋亡取决于激活信号的差异和所在细胞的类型〔4〕。

骨髓内细胞极易受到辐射损伤，导致人体造血免疫功能障碍。射线可伤及骨髓内重要的造血细胞和骨髓基质细胞，启动这些细胞的凋亡过程。NF-κB的激活是细胞凋亡通路的始动因素，而Bcl-2家族成员比例关系是调控细胞凋亡的关键因素，特别是bcl-2/bax比值是决定细胞生死的“平衡砝码”。bax和bcl-2以同源或异源二聚体的形式来调节细胞凋亡过程：当bax-bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；bax-bcl-2形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡〔5〕。

在辐射损伤后，MSC和骨髓细胞凋亡过程均由NF-κB信号分子活化启动。本研究发现，辐射可激活体内外细胞NF-κB信号分子，启动细胞的凋亡程序，当归补血汤以其多药效部位多作用靶点的特点，通过对参与细胞凋亡的NF-κB-bcl-2-bax信号通路，发挥其抗辐射损伤的作用，减少骨髓内细胞凋亡数，保护了机体的造血免疫器官。但实验中出现了离体与在体间同一指标的变化差异，这可能与动物体内参与细胞凋亡的环境更为复杂有关，具体机制还有待进一步研究。

4参考文献

1Gloire G，Piette J.Redox regulation of nuclear post-translational modifications during NF-κB activation〔J〕.Antioxid Redox Signal,2009；11(9)：2209-22.

2於亮亮，于皆平，罗和生.核因子-κB与细胞凋亡关系的研究进展〔J〕.世界华人消化杂志.2003；11(10)：1628-31.

3Ichikawa H，Takada Y，Murakami A，etal.Identification of a novel blocker of IκBα kinase that enhances cellular apoptosis and inhibits cellular invasion through suppression of NF-κB-regulated gene products〔J〕.J Immunol，2005；174(11)：7383-92.

4Agnieszka Siomek.NF-κB signaling pathway and free radical impact〔J〕.actabp.pl.2012；59(3)：323-31.

5Lalier L，Cartron PF，Juin P，etal.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis〔J〕.Apoptosis，2007；12(5)：887-96.

〔2014-09-29修回〕

(编辑郭菁/徐杰)