植物凝集素PHA-L对小鼠急性辐射防护作用

张广慧 吴红英 靳 瑾 周则卫 刘培勋 龙 伟

（中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所 天津 300192）



植物凝集素PHA-L对小鼠急性辐射防护作用

张广慧 吴红英 靳 瑾 周则卫 刘培勋 龙 伟

（中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所 天津 300192）

摘要观察植物凝集素PHA-L对小鼠急性辐射损伤的保护作用及相关机制。采用动物30d存活率实验，即小鼠全身辐照至吸收剂量为7.2Gy后观察其存活情况；利用外周血和免疫学实验，小鼠全身照射至吸收剂量为7.2 Gy后测外周血白细胞数(White blood cell, WBC)、股骨有核细胞数(The number of nucleated cells in bone marrow, BMNC)、骨髓DNA含量以及各脏器指数；对小鼠进行9.0 Gy腹部照射，取小肠组织做病理切片观察。结果显示，照射给药组小鼠30 d存活率比单纯照射组均有提高，特别是高剂量组提高约60%；与单纯照射组相比，照射给药高剂量组的白细胞数、骨髓DNA含量和脾结节数均有提高，分别从0.74±0.16、1.02± 0.17和9.80±6.46提高到1.18±0.40、1.22±0.17和18.10±6.87，数据均有统计学意义(p<0.05)，并且PHA-L对脏器也有一定的保护作用；与单纯照射组相比，照射给药高剂量组小鼠肠道组织损伤恢复明显。提示植物凝集素PHA-L对急性辐射损伤具有保护作用，但其作用机制有待进一步研究。

关键词辐射损伤，植物凝集素PHA-L，放射性肠炎

基金资助：国家自然科学基金青年项目(81202153)、教育部博士点新教师基金(20121106120042)、天津市应用基础与前沿技术研究计划青年项目(14JCQNJC10900)和中国医学科学院放射医学研究所发展基金(1523)资助

第一作者：张广慧，女，1987年5月出生，2011年毕业于泰山医学院，现为中国医学科学院放射医学研究所硕士研究生，研究方向为辐射防护食品药品研究，E-mail: iamzgh@yeah.net

Supported by National Natural Science Foundation of China(81202153), Doctoral Found of Ministry of Education(20121106120042), Tianjin application foundation and research in cutting-edge technologies program(14JCQNJC10900), and Development Fund of

Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences(1523)

First author: ZHANG Guanghui (female) was born in May 1987 and graduated from Taishan Medical University in 2011. Now she is a master candidate at Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, majoring in radiation protection food

and drug research. E-mail: iamzgh@yeah.net

Received 29 October 2015; accepted 26 November 2015

CLC R979.6, TL7

随着清洁无污染的核能得到广泛的开发和应用，尤其是核电站的建设数量呈现上升趋势，使得核辐射事故的发生也呈现增加趋势，特别是日本福岛核电站事故的发生，造成了严重的放射性环境污染和人员伤亡。随着肿瘤患者的增加，放疗治疗也给患者带来一定的辐射损伤[1-4]。电离辐射作用于机体后，一是直接作于细胞核内的DNA 分子[5]，造成DNA分子断裂或碱基对错误结合，引起急性辐射损伤；二是间接作用于水分子，继而生成自由基，自由基的化学性质活泼，有极强的氧化反应能力，再作用于生物大分子，造成长期辐射损伤[6-7]。此外，辐射还会造成一些酶活性的改变，影响细胞的正常代谢途径，致使代谢紊乱，进而使免疫、神经和内分泌系统的调节功能改变[8]。人体自身存在一套完整的氧化还原系统包括多种抗氧化酶[9-10]，可清除体内多余的自由基，使体内自由基水平保持一个动态平衡。因此，提高机体免疫力、增强抗氧化酶的活性和修复损伤的DNA是目前开发抗辐射损伤药物主要的研究思路。

植物凝集素是一类从植物中提取的，具有特异糖结合活性的蛋白，具有一个或多个可以与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化结构域，因其能凝集红血球，故名凝集素[11]。PHA-L是从红腰豆中提取的凝集素。PHA-L作为一种有丝分裂原在生物及免疫学实验方面有所应用。本研究通过动物实验发现植物凝集素PHA-L对小鼠急性辐射损伤具有保护作用，并通过细胞实验推测这一作用发生可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与动物

PHA-L购自Medicago公司，用生理盐水配制成溶液以待使用。

C57BL/6雄性小鼠（SPF级）由北京大学医学部提供，合格证号[SCXK（京）2011-0012]，体重18～20 g。每笼5只饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物实验中心SPF级动物房（饲养设施合格证号：SVXK津2009-0002）。

1.2 主要仪器

照射源为加拿大Atomic Energy公司生产的137Cs g-射线辐照仪，剂量率为1.0 Gy/min，血细胞计数仪BC-2800vet，紫外分光光度计ZW0307060610，电子精密天平PL203。

1.3 30 d存活率实验

1.3.1 动物实验与分组

将80只ICR雄性小鼠分为5组，即正常对照组、单纯照射组、照射给药高、中和低3个剂量组(2.5、5.0、10 mg/kg)，每组16只。对照组给予假照射，单纯照射组和照射给药组小鼠接受全身7.2 Gy照射，照射给药组照射前3 d每天腹腔注射给药1次，共3次，第3次给药后1 h照射，以后每天按原方案给药，连续7次。

1.3.2 观察指标

每天观察记录各组小鼠的存活情况，并计算出小鼠的30 d存活率、平均存活时间和保护指数。30 d存活率(%)=（照射后每组小鼠的存活数/每组小鼠总数）×100%，根据公式计算保护指数，保护指数=[(ab+30c)/n]/[(ab+30c )/n]。式中：a、a分别为给药组与单纯照射组死亡鼠平均存活天数；b、b分别为给药组与单纯照射组死亡小鼠数；c、c分别为给药组与单纯照射组的30 d存活只数；n、n分别为给药组与单纯照射组总小鼠数。

1.4 外周血及脏器指数实验

1.4.1 实验动物分组及给药方式

20只C57BL/6雄性小鼠分为单纯照射组和照射给药组，每组10只。对照组给予假照射，给药组均接收7.2 Gy全身照射，照射条件同上，照射给药组给药方案同上，按高剂量10 mg/kg给药。

1.4.2 造血系统指标

白细胞数(White blood cell, WBC)：照射后第7天，小鼠摘眼球取血20 mL，加入到100 mL EDTA-2Ka的抗凝剂中，用全自动血液细胞分析仪检测白细胞数。股骨有核细胞数(The number of nucleated cells in bone marrow, BMNC)：小鼠称重后，颈部脱臼处死，取小鼠一侧股骨，用股骨有核细胞醋酸液(3%)反复冲洗骨髓腔，混匀后，取少许滴入计数板，在电子显微镜下计算股骨有核细胞数。DNA含量测定：取小鼠另一侧股骨，用氯化钙溶液按上述方法冲洗骨髓，放置、离心、弃上清后，加高氯酸反应液，混匀、加热、冷却、过滤，滤液在268 nm处测吸光度(A)值。

1.4.3 免疫指标

脾结节(CFU-S)照射后第7天，颈椎脱臼处死小鼠，解剖将其脾脏取出放入固定液中，约24 h后取出，肉眼观察计数脾脏表面突出的结节数(CFU-S)。脏器指数：解剖小鼠取胸腺、脾、胰、肝脏、肾、心脏和性腺，称质量，按下列公式计算胸腺、脾、胰、肝、肾、心和性腺指数。

脏器指数=(脏器重量/体重)×1 000。

1.5 肠道辐射损伤观察

1.5.1 动物分组及给药方式

30只C57BL/6雄性小鼠按体重随机分为空白对照组(Control)、单纯照射组(IR)、照射给药组(IR+PHA-L)，每组10只。空白对照组给予假照射，其他两组接收9.0 Gy腹部照射，照射给药组给药方案同上，按高剂量10 mg/kg给药。

1.5.2 病理切片观察

照射后第3天小鼠脱颈处死，取小肠组织处理，10%中性甲醛固定，24 h后脱水并制作石蜡块。之后采用传统实验方法进行HE染色，通过形态学变化观察小肠的辐射损伤程度与恢复情况。

1.6 数据处理

小鼠30 d生存实验数据采用GraphPad 5生存分析，其余数据均以±s表示，用SPSS19.0软件包分析数据，使用Student-Newman-Keuls进行多组间显著性差异分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 30 d存活率

观察记录30 d内小鼠存活情况，用GraphPad5法计算生存率并作图。实验结果见图1和表1。与单纯照射组相比，PHA-L在10 mg/kg的给药剂量，能显著提高小鼠30 d存活率，提高幅度约60%，其保护指数为1.88，并且能够明显延长小鼠的平均生存天数。中剂量5 mg/kg也有一定的保护作用。表明PHA-L对受照小鼠辐射损伤有较好的整体保护作用。

表1　受照小鼠平均生存时间与保护指数Table 1　Average survival time and index of mice after radiation

2.2 血象和免疫实验结果

血象和免疫实验结果列于表2和表3。由表2可知，与单纯照射组相比，PHA-L以10 mg/kg的剂量给药时，可明显提高受照小鼠的白细胞数、股骨有核细胞数、骨髓DNA含量和脾结节数，表明PHA-L对辐射小鼠的造血系统有较好的保护作用；由表3可知，与单纯照射组相比，PHA-L可提高辐射小鼠的脾指数、胸腺指数和肝指数，提示PHA-L对受照小鼠的免疫系统也有一定的保护作用。综上，PHA-L能够在一定程度上减轻辐射对造血系统和免疫系统的损伤作用。

表2　PHA-L对辐射损伤小鼠造血系统的保护作用Table 2　 Protective effects of PHA-L on hematopoietic system in irradiated mice

表3　PHA-L对辐射损伤小鼠脏器的保护作用Table 3　Protective effects of PHA-L on organs in irradiated mice

2.3 肠道病理切片观察

各实验组肠道病理切片观察结果见图2。由图2可以看出，当给药剂量为10 mg/kg时，PHA-L能显著改善电离辐射导致的小肠粘膜绒毛水肿及绒毛结构脱落，对小肠的电离辐射损伤具有明显的保护与促进再生作用。

3 讨论

植物凝集素是来源于植物的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质。由于其对于单糖或糖复合物特异性结合的能力，使得其在如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用。同时植物凝集素具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌、促进外周血淋巴细胞的增值以及诱导凋亡等多种能力[8,12]。近年来，随着研究的深入，植物凝集素新的生物功能不断被发现，特别在对Toll样受体的作用方面[13]，可激活TLP4受体。Xu等[14]运用脂多糖刺激小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7 和人巨噬细胞后发现大量自噬体形成，在将 T L R 4 抑制后自噬体形成明显减少，说明TLR4 在识别 LPS 后能够触发自噬反应。所以植物凝集素PHA-L或许能够引发自噬效应，随后我们还做了PHA-L的自噬诱导实验，发现PHA-L表现出很强烈的自噬效应（未发表资料）。

植物凝集素PHA-L可有效减少受照小鼠急性期死亡率，延长照射小鼠生存时间，提示植物凝集素PHA-L对受照射小鼠有较好的整体防护作用。0～10 Gy电离辐射主要引起造血系统损伤，外周血白细胞数显著下降[15-16]，我们研究了植物凝集素PHA-L对受照射小鼠造血系统和免疫系统的影响，发现其可提高受照小鼠的白细胞数、骨髓DNA含量、股骨有核细胞数和脾结节数，提示植物凝集素PHA-L有升白作用，对免疫系统和造血系统有一定的保护作用，我们认为这可能与其免疫调节作用有关，其机制有待进一步的研究。

本研究还发现，植物凝集素PHA-L能显著改善电离辐射导致的小肠粘膜绒毛水肿及绒毛结构脱落，这表明PHA-L对肠道辐射损伤有明显的保护作用。PHA-L可引发自噬效应，自噬是细胞在适应各种生存压力下的重要反应， 同时能够通过快速而相对简单的过程清除胞内微生物而参与免疫反应[17]。肠道细胞在受到辐射作用的直接损伤之后，DNA断裂，又或发生DNA修复，这些作用可能导致细胞的畸变，继而负累整个肠道系统。这时候细胞的自噬将加大机体对损伤细胞的主动清除，为受伤组织的重生修复扫清道路。PHA-L的自噬诱导作用可能有助于促进小鼠肠道细胞对辐射损伤细胞的清除，加速肠道组织的修复。虽然有关自噬与放射性肠炎之间的关系鲜有报道，但这种新的药理机制阐明也有可能为肠道辐射损伤的药物研究提供新的方向。

植物凝集素PHA-L可激活Toll受体，其下游主要激活NF-κB信号通路。研究发现，NF-κB信号通路持续激活是肿瘤福射抗性的重要分子机制，这一机制提供了研究新型抗辐射损伤药物的新思路：即通过激活NF-κB细胞信号通路可以增强机体的抗福射损伤作用。植物凝集素PHA-L的抗辐射作用的机制可能与激活NF-κB通路有关。

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Protective effects of the plant lectin PHA-L on acute radiation injuries in mice

ZHANG Guanghui WU Hongying JIN Jin ZHOU Zewei LIU Peixun LONG Wei
(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China)

ABSTRACTThe aim is to observe the protective effects of plant lectin PHA-L against radiation injuries and the relative mechanism. 30 d survival experiment was used to observe the survival condition of mice 30 d after irradiation with 7.2 Gy γ-rays. Blood and immunological experiments of mice were carried out to observe WBC (White blood cell), femoral nucleated cells, bone marrow DNA content and organs index after irradiation with 7.2 Gy γ-rays. Intestine pathological section of mice irradiated on abdomen with 9.0 Gy γ-rays was prepared to observe the pathology of intestine. The results showed that compared with the irradiation group, the survival rate of mice treated with PHA-L increased, especially for the high dose group (60% lifted); compared with the irradiation group, whitebook=47,ebook=16blood cell count, bone marrow DNA content and spleen nodules of mice administered with high dose group increased from 0.74±0.16, 1.02±0.17 and 9.80±6.46 to 1.18±0.40, 1.22±0.17 and 18.10±6.87 respectively, which were statistically significant (p<0.05). Moreover, PHA-L also had some protective effect on the organ. In pathology observation, the intestines of mice treated with PHA-L recovered significantly as well. Therefore, plant lectin PHA-L can protect mice from radiation injuries, yet the mechanism needs further study.

KEYWORDSRadiation damage, Plant lectin PHA-L, Radiation intestine

Corresponding author:Ph.D. LONG Wei, associate professor, E-mail: longway@irm-cams.ac.cn

收稿日期：初稿2015-10-29；修回2015-11-26

通讯作者：龙伟，博士，副研究员，E-mail: longway@irm-cams.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020203

中图分类号R979.6，TL7