非水毛细管电泳法测定山莨菪中4种莨菪烷类生物碱

柯月娇, 黄桂华, 张苏娜, 聂正晴, 余丽双, 李 琦

(福建中医药大学药学院, 福建省中药学重点实验室， 福建 福州 350122)

非水毛细管电泳法测定山莨菪中4种莨菪烷类生物碱

柯月娇, 黄桂华, 张苏娜, 聂正晴, 余丽双, 李 琦

(福建中医药大学药学院, 福建省中药学重点实验室， 福建 福州 350122)

通过考察电泳分析条件对山莨菪中莨菪烷类生物碱分离和测定的影响， 建立中药材山莨菪中阿托品、 山莨菪碱、 东莨菪碱和樟柳碱4种莨菪烷类生物碱非水毛细管电泳分析(NACE)的新方法. 结果表明， 在分离电压为28 kV、 检测波长210 nm， 缓冲体系为40 mmol·L-1Tris溶液(水 ∶甲醇 = 1 ∶3， 体积比， pH=7.0)的条件下， 4种组分在7.5 min内实现基线分离， 阿托品在5～70 μg·mL-1、 樟柳碱在5～30 μg·mL-1、 山莨菪碱和东莨菪碱在2～25 μg·mL-1的浓度范围内均具有良好的线性关系， 检测限分别达到0.45、 0.5、 1.0、 0.8 μg·mL-1. 该方法用于山莨菪中莨菪烷类生物碱的测定， 结果令人满意.

非水毛细管电泳； 山莨菪； 阿托品； 山莨菪碱； 东莨菪碱； 樟柳碱

0 引言

山莨菪(Anisodustanquticus(Maxim) Pascher)为多年生茄科山莨菪属草本植物， 又名唐古特山莨菪、 樟柳， 是我国的特有植物, 也是较常用藏药品种， 主要分布在甘肃、 西藏、 云南、 青海等地， 生长在中高海拔的土坡、 河滩及避风向阳的山谷. 其性温， 味辛、 甘， 有毒， 主要含有山莨菪碱、 莨菪碱、 东莨菪碱、 樟柳碱、 红古豆碱等多种生物碱， 有解痉、 镇痛、 催眠作用， 常用于急性肠炎、 红肿疔毒、 溃疡病跌打损伤、 恶疮肿痛等症的治疗， 对暴发型流行性脑脊髓膜炎、 中毒型痢疾等疾病的治疗有非常显著的疗效[1-2].

山莨菪是提取莨菪烷类生物碱的重要中药资源植物， 同时也是国家二级重点保护野生植物， 采摘受到限制. 为了提高其产量， 现多以人工引种栽培品种为主. 而随着人工栽培产量的提高， 对人工种植山莨菪进行质量控制， 特别是对其中主要生物碱的快速测定成为必要. 已报道文献中大多是用高效液相色谱法[3-4]对山莨菪中生物碱的含量进行测定， 也有用毛细管电泳-电化学发光法(CE-ECL)测定其中2种生物碱(樟柳碱和山莨菪碱)[5]、 用区带毛细管电泳(CZE)对莨菪浸膏片中的生物碱[6]及用涂层毛细管电泳法对洋金花中3种生物碱[7]进行分离的报道， 尚未发现有使用非水毛细管电泳法(NACE)对山莨菪中4种莨菪烷类生物碱同时进行分析测定的报道. 由于使用非水溶剂作为电泳介质， NACE除了具有CE法本身高效、 快速、 简便等特点外， 更有利于对在水中不稳定的物质和疏水化合物的分析.

采用以甲醇为溶剂的NACE法同时分离测定山莨菪中阿托品、 山莨菪碱、 东莨菪碱和樟柳碱4种莨菪烷类生物碱. 实验发现这4种生物碱在非水溶液中具有更好的稳定性， 而且用NACE法进行分析具有更低的检测限， 更有利于山莨菪中生物碱的分析， 可为该药材种植过程中的质量控制提供参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BECKMAN P/ACETMMDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司， 配备DAD二极管阵列检测器)； 未涂层弹性石英毛细管， 50 cm × 75 μm(id)， 有效长度40 cm(永年锐沣色谱器件有限公司)； 雷磁PHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)； Sartorius DS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)； KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

硫酸阿托品对照品(卡迈舒生物科技有限公司)； 氢溴酸东莨菪碱对照品(上海远慕生物科技有限公司)； 氢溴酸山莨菪碱、 氢溴酸樟柳碱对照品(中国食品药品检定研究院)； Tris试剂(Solarbio)； 硼砂、 磷酸等均为分析纯(上海联试化工试剂有限公司)； 甲醇为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)； 所用水均为超纯水； 山莨菪药材(青海西宁三江宝商贸公司藏蒙药材商行).

1.2 对照品溶液的配制

精密称取4种生物碱对照品各5.0 mg， 用甲醇配制成质量浓度各为1.0 mg·mL-1的对照品储备液， 密闭置于4℃下避光保存， 实验时用75%(体积分数， 以下同)甲醇稀释至所需浓度.

1.3 样品溶液的制备

山莨菪药材中生物碱的提取与制备： 精密称取山莨菪粉末(过粒径270 μm筛)1 g， 置具塞锥形瓶中， 1.5 mL浓氨湿润后， 加入30 mL氯仿， 放置24 h； 滤过， 收集滤液并补足至30 mL. 取滤液5 mL， 回收溶剂至干， 残渣用75%甲醇溶解， 转移至10 mL量瓶中， 75%甲醇定容至刻度， 摇匀， 用0.45 μm微孔滤膜过滤并脱气， 即得山莨菪样品溶液.

1.4 电泳条件

未涂层石英毛细管(50 cm × 75 μm)， 检测波长210 nm， 温度25 ℃， 分离电压28 kV， 压力进样3.5 kPa×8 s， 缓冲溶液40 mmol·L-1Tris-75%甲醇(pH=7.0). 毛细管柱使用前分别用超纯水、 0.1 mol·L-1的NaOH、 超纯水和缓冲液各冲洗5、 10、 10、 5 min, 每次进样前用电泳缓冲液冲洗3 min; 实验结束后用0.1 mol·L-1的NaOH、 超纯水各冲洗10 min.

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将4种生物碱对照品溶液在200～300 nm范围内进行紫外光谱扫描， 从图1所示的光谱图中可以观察到山莨菪碱、 东莨菪碱、 樟柳碱和阿托品的最大吸收波长分别为208、 206、 203、 205 nm. 实验时通过二极管阵列检测器同时检测记录它们在200、 205、 210 nm波长下的电泳谱图. 分析并比较测定结果后发现在210 nm处， 4种生物碱均能产生较强的紫外吸收并且干扰小， 同时也有较高检测灵敏度， 故选择210 nm为检测波长.

2.2 缓冲体系的选择

实验考察了硼酸盐-甲醇、 乙酸盐-甲醇和Tris-甲醇三种缓冲体系. 结果表明： 缓冲体系为硼酸盐-甲醇时， 样品组分无法分离且电流不稳定； 缓冲体系为乙酸盐-甲醇时， 体系不稳定； 而缓冲体系为Tris-甲醇时， 对分析物的总体分离效果均优于前两者， 可能原因是Tris体系具有更低的电子迁移率， 整个体系更稳定， 故选择Tris-甲醇为缓冲体系.

2.2.1 缓冲溶液浓度的影响

缓冲溶液浓度会影响分析物质的迁移时间， 进而影响分离度. 实验选定Tris-甲醇体系后， 考察了Tris浓度在10～100 mmol·L-1范围内4种生物碱的分离情况. 当Tris浓度大于100 mmol·L-1时， 该体系容易盐析从而使毛细管堵塞. 而在10～100 mmol·L-1范围内， 随着浓度提高， 出峰时间滞后， 峰间距呈现增大趋势； 浓度降低， 则组分分离度下降. 综合考虑后选择缓冲溶液Tris浓度为40 mmol·L-1. Tris浓度对分离的影响见图2.

2.2.2 甲醇体积分数的影响

甲醇作为溶剂时， 其体积分数越高则电流越小、 峰形越尖锐， 但出峰变慢、 峰间距增大. 当甲醇体积分数高于80%时， 虽然组分的峰形和峰间距都较好， 但在该体系下溶液易盐析， 整个缓冲体系不稳定； 而当甲醇体积分数低于70%时， 后两组分不能达到基线分离. 基于分离效果和稳定性的总体考虑， 选择甲醇体积分数为75%.

2.2.3 缓冲溶液pH值的影响

缓冲溶液pH值是影响毛细管电泳分析的重要因素之一. 实验考察了pH值在6.55～8.50范围内的缓冲溶液(40 mmol·L-1Tris-75%甲醇)对分离的影响. 实验结果如图3所示， pH值影响组分的出峰时间、 峰间距以及分离度大小， 综合考虑后选择pH=7.0的Tris-甲醇溶液作为电泳缓冲溶液.

2.3 分离电压的选择

分离电压决定电泳的电场强度、 电渗流和电泳速度， 是影响分离效率和迁移时间的重要因素. 实验以40 mmol·L-1的Tris-75%甲醇溶液(pH=7.0)为电泳介质， 考察了分离电压在20～30 kV范围内对4种生物碱分离的影响. 结果表明： 随着分离电压增大， 电渗流和电泳速度都增大， 迁移时间缩短， 峰间距减小， 分离度变小， 同时电流增大. 考虑到仪器的最大承载电压为30 kV， 故选择分离电压为28 kV， 此时分离度和出峰时间综合较好.

2.4 进样时间的选择

在分离电压为28 kV， 柱温25 ℃， 进样压力3.5 kPa条件下， 考察进样时间在3～10 s范围内对分离的影响. 结果如图4所示： 进样时间太短时， 进样量小， 组分较难测量且相对误差也较大； 随着进样时间增加， 进样量增大， 峰形尖锐， 但峰间距缩小， 分离度变小. 综合考虑各因素后选择进样时间为8 s.

2.5 最佳分离条件下的样品谱图对照

综上， 最佳的电泳分离条件为： 40 mmol·L-1的Tris-75%甲醇溶液(pH=7.0)， 分离电压28 kV， 柱温25 ℃， 进样压力3.5 kPa， 进样时间8 s. 通过比较迁移时间和加入对照品对照的方法对样品峰进行定性. 在最佳分离条件下， 4种生物碱的对照品溶液电泳谱图和山莨菪样品谱图如图5所示. 图中对照品与样品组分迁移时间有略微差异的原因， 可能是样品溶液基体较对照品溶液复杂， 故组分迁移时间受影响.

2.6 线性关系、 检测限和精密度考察

精密量取阿托品、 山莨菪碱、 东莨菪碱和樟柳碱对照品储备液， 用75%甲醇制备成一系列不同浓度的混合对照品溶液， 以选定实验条件进行分析， 重复进样3次， 考察峰面积与质量浓度ρ(μg·mL-1)的线性关系以及分析物的检出限(S/N=3). 此外， 取一定浓度的混合对照品溶液， 连续进样6次， 计算其峰面积A和迁移时间RSD值. 所得结果列于表1. 由表1可知，R值在0.997 0～0.999 6之间， 表明各组分在一定范围内线性良好， 结果令人满意. 精密度考察结果显示各组分峰面积的RSD(n=6)为1.16%～2.06%， 迁移时间的RSD(n=6)为0.50%～0.84%， 表明该方法精密度良好.

表1 线性关系、 检测限和精密度实验结果Tab.1 Regression equations, detection limits and precision

2.7 重复性、 稳定性、 样品测定和加标回收实验

精密称取山莨菪细粉6份， 按样品溶液制备方法平行制备样品， 以选定实验条件进行分析， 每份样品重复进样3次， 计算得到6份平行样品中阿托品、 山莨菪碱、 东莨菪碱和樟柳碱含量的RSD值分别为1.49%、 2.68%、 2.58%和1.03%， 说明该方法重复性良好. 此外， 连续测定同一份供试品溶液分别在第0、 6、 12、 24、 36、 48 h时4种生物碱的峰面积， 计算得到4种生物碱48 h内峰面积的RSD值分别为2.56%、 2.17%、 2.22%、 1.80%， 说明该方法在48 h内稳定性良好.

在最佳电泳条件下， 用所建立的方法对山莨菪中4种生物碱进行了分离测定. 用表1中回归方程计算得到4种生物碱的平均含量及RSD值， 结果列于表2. 同时为了验证方法的准确性， 进行了加标回收实验. 精密称取已知含量的山莨菪样品粉末9份， 每份0.5 g. 分3个加入量分别准确加入四种生物碱对照品， 每个加入量平行制备3份加标样品， 按“样品溶液制备”项下方法处理， 进行加标回收实验， 结果列于表3. 4种生物碱的平均回收率在97.59%～102.4%之间， RSD在2.18 %～2.82%之间， 说明该方法准确度较高、 方法可靠， 可以满足4种生物碱含量的测定要求.

表2 山莨菪样品测定结果Tab.2 Analysis results of Anisodus sample

表3 回收率结果Tab.3 Results of recovery

3 结语

研究建立了山莨菪中4种莨菪烷类生物碱的NACE分析新方法， 考察了缓冲溶液体系组成、 分离电压、 检测波长、 进样时间等因素对4种生物碱分离的影响. 详细考察了缓冲体系组成(浓度、 pH值、 有机溶剂)对分离的影响， 发现体系中存在75%甲醇， 可以提高生物碱的溶解度和稳定性， 从而提高分离度和方法的灵敏度(检出限在0.45～1.00 μg·mL-1之间)， 该灵敏度高于文献报道的水相区带毛细管电泳方法[6]. 而与文献报道的高效液相色谱法[4]相比， NACE方法更具有分析时间短、 方法简单、 分离效率高、 环保等优势， 可用于山莨菪药材、 复方制剂和中草药制品中莨菪烷类生物碱的快速测定， 并可为山莨菪人工种植过程中的质量控制提供参考. 若结合样品在线富集技术， 进一步改善方法分析灵敏度， 该方法在生物体内样品分析中将具有巨大的潜力.

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(责任编辑： 洪江星)

Simultaneous determination of four tropane alkaloids inAnisodustanguticusby nonaqueous capillary electrophoresis

KE Yuejiao, HUANG Guihua, ZHANG Suna, NIE Zhengqing, YU Lishuang, LI Qi

(College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fujian Key Laboratory of Chinese Materia Medica， Fuzhou， Fujian 350122， China)

A capillary electrophoresis method has been developed for the determination of four tropane alkaloids, atropine, anisodamine, scopolamine, anisodine inAnisodustanguticusafter an investigation of basic factors which govern the nonaqueous capillary electrophoresis (NACE) separation of these alkaloids. The results showed that the four components could be well separated within 7.5 min at a separation voltage of 28 kV in a 40 mmol·L-1Tris system running buffer (water: methanol = 1 ∶3， volume ratio, pH=7.0) when the detection wave was set at 210 nm. A good linear relationship was observed in the range of 5～70, 5～30 μg·mL-1for atropine and anisodine respectively, 2～25 μg·mL-1for anisodamine and scopolamine. The detection limits were 0.45, 0.5, 1.0, 0.8 μg·mL-1for them. The method has been applied to the analysis of the four tropane alkaloids inAnisodustanquticus, and the result was satisfactory.

nonaqueous capillary electrophoresis;Anisodustanguticus; atropine; anisodamine; scopolamine; anisodine

10.7631/issn.1000-2243.2016.05.0723

1000-2243(2016)05-0723-05

2015-03-23

李琦(1976-)， 副教授， 主要从事药物色谱与光谱分析方面的研究， hellorickey@sina.com

国家自然科学基金资助项目(81202913)； 福建省科技厅社发处重点资助项目(2013Y0057)； 福建中医药大学重点学科专项校管课题资助项目(X2014115-学科)

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