重组人粒细胞集落刺激因子对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠凋亡诱导因子表达的影响

路黎娟,徐梅佳,董 焱

·基础医学·

重组人粒细胞集落刺激因子对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠凋亡诱导因子表达的影响

路黎娟,徐梅佳,董 焱

目的：研究分析重组人粒细胞集落刺激因子对新生SD大鼠凋亡诱导因子表达的影响。方法：随机选取7日龄SD大鼠36只，随机分为假手术组(A组)、脑缺血再灌注组(B组)和药物治疗组(C组)，每组各12只。采用Longa线栓法制作大鼠大脑动脉闭塞再灌注模型，C组大鼠在脑缺血2 h后及24 h时给予药物灌注，其余2组给予大鼠注射等量的0.9%氯化钠注射液。实验结束后，采用Longa 5分制标准评分法在24 h时对大鼠的神经功能进行评分，采用免疫组织化学法对大鼠的组织磷酸化c-jun氨基末端激酶、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶进行检测，同时采用原位末端转移酶标记对神经细胞凋亡、TTC染色测脑梗死体积进行相关检测。对凋亡相关基因的表达及凋亡水平进行评价。结果：A组仅有一小部分凋亡细胞，B、C 2组在灌注24 h后可以发现大量的凋亡细胞，细胞核均呈棕褐色，主要分布在缺血脑组织中周围；C组脑梗死程度较B组减轻(P<0.01)。结论：重组人粒细胞集落刺激因子可以起到保护新生SD大鼠神经细胞的作用，避免发生缺血缺氧性脑损伤，这种糖蛋白与细胞凋亡相关基因的表达有关。

脑损伤；缺血缺氧性;重组人粒细胞集落刺激因子；大鼠

新生儿缺血缺氧性脑病是指患儿在围生期发生窒息，导致脑组织缺氧性损伤，是新生儿的常见病之一。该病发病机制复杂，涉及多个环节，而细胞凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的重要原因[1]。脑组织一旦发生损伤，很有可能进一步引起患儿神经细胞发生损伤，很多患儿均遗留下不同程度的神经系统后遗症，严重影响着患儿正常的生活。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)可以刺激中性粒细胞的产生，并且rhG-CSF对大脑组织起到保护作用，可以修复并改善神经系统的功能[2]。细胞凋亡的过程中受到多种基因调控及外界因素的影响，本研究通过建立新生SD大鼠大脑动脉闭塞再灌注模型，旨在研究rhG-CSF对大鼠凋亡诱导因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 实验动物：为我院实验动物管理中心提供的新生7日龄清洁级健康SD大鼠36只，每只质量12～15 g。试验仪器：博士德SA2001免疫组织化学试剂盒(上海泽迈技术有限公司)；TBBY-3503-50 mL DAB显色试剂盒(上海拓旸生物科技有限公司)；TUNEL试剂盒(上海美轩生物科技有限公司)；上海君瑞JR01523PBS粉剂(上海君瑞生物技术有限公司)；BL-HC-0570微量加样器(上海博光生物科技有限公司)；TC-150Q病理组织脱水机(沈阳市龙首电子仪器有限公司)；TB-FL1病理组织包埋机(武汉天之瑞医疗科技有限公司)。实验试剂：RHG-CSF(北京四环生物制药有限公司)；兔抗大鼠p-JNK1/2单克隆抗体(北京博奥森生物技术公司)；兔抗大鼠p-ERK1/2单克隆抗体(北京博奥森生物技术公司)；构椽酸盐缓冲液(0.01 mmol/L,pH 6.0)(ZLI-9064)。

1.2 方法 将所有大鼠随机分为假手术组(A组)、脑缺血再灌注组(B组)和药物治疗组(C组)，每组各12只。每组再次随机选出6只大鼠，分别进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，并测定其脑梗死体积，其余6只大鼠采用免疫组织化学法检测磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)及磷酸化胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)水平的表达，利用Tunel检测神经细胞凋亡情况。A组仅将大鼠颈部的动脉进行分离；B、C组采用Longa线栓法制作大鼠大脑动脉闭塞再灌注模型，在大鼠缺血2 h后进行药物灌注；完成模型的建立后，C组大鼠在再灌注时及24 h时给予注射rhG-CSF，剂量为50 μg/kg，其余2组给予小鼠注射相同体积的0.9%氯化钠注射液。

1.2.1 线栓法制作大鼠大脑动脉闭塞再灌注模型[3]首先使用尼龙鱼线制作直径约为0.28 mm的线栓，采用改良线栓法对大鼠右侧的大脑中动脉进行阻断，建立局灶性脑缺血再灌注模型。所有大鼠在手术前禁食12 h，饮水不限制。对大鼠进行麻醉，取仰卧位，手术部位进行消毒，对颈部进行切割，使其颈动脉暴露在外部，在颈总动脉分叉处一切口，将鱼线沿切口插入，其次对颈动脉进行挂线结扎(防止出血)，缓慢推进线栓，使其置于颈内动脉17～18 mm处，出现轻微阻力时即停止推动。再缝合皮肤并做标记。缺血后2 h时对大鼠进行灌注。A组大鼠仅分离颈部不插鱼线。

1.2.2 标本收集与处理 在完成行为学指标检测后，麻醉大鼠，剥开大鼠胸部使其心脏暴露，剪开右心耳，给予灌注100 mL 0.9%氯化钠注射液(37 ℃)，将血渍冲洗干净后，给予灌注250 mL多聚甲醛(4%，pH 7.4)，标本固定后取大鼠头脑组织浸泡于10%甲醛中，24 h后取出，制片[4]。

1.2.3 指标检测 分别进行TTC染色测定脑梗死体积，免疫组织化学染色检测p-JNK、p-ERK，原位末端转移酶标记(Tunel)检测细胞凋亡。

1.3 评定标准

1.3.1 神经功能评分及入选标准 采用Longa 5分制标准评分法[3]在24 h时对大鼠的神经功能进行评分，评分等级有0～4分，其中，0分：无神经功能损伤症状；1分：大鼠左侧前肢无法正常伸展；2分：大鼠在术后行走向左转圈；3分：大鼠在术后行走向左倾斜；4分：不能正常行走，没有意识。将0分及4分的大鼠剔除，并补足。

1.3.2 TTC染色 在完成染色后，使用数码相机拍照，利用图像处理软件计算脑梗死的体积，计算梗死体积占大脑总体积的百分比。

1.3.3 免疫组织化学染色 在完成染色后，若免疫细胞被染成棕黄色即为p-JNK1/2和p-ERK1/2阳性细胞。采用B-I2000医学图像分析系统测量染色阳性细胞的平均灰度值[5]。

1.3.4 Tunel凋亡细胞 在完成染色后，若细胞被染成棕黄色即为Tunel阳性细胞，则细胞凋亡。计算阳性细胞的百分比平均值。

1.4 统计学方法 采用方差分析和q检验及t检验。

2 结果

2.1 模型建立情况 A组大鼠没有出现死亡现象且神经功能正常；B组大鼠手术后精神情况不佳、活动少、反应迟缓且进食相对于A组较少，且大鼠的左侧前后肢均不能正常伸展，行走时有向左侧倾斜的趋势，严重者会摔倒；C组大鼠的情况较为正常，明显优于A、B 2组。

2.2 3组小鼠神经功能评分及脑梗死体积比较 A组小鼠无神经功能发生损伤者，神经功能评分为0分，B、C 2组小鼠的神经功能均发生不同程度的损伤，B组神经功能评分明显高于C组(P<0.01)。TTC染色结果显示，染色梗死区显示白色，非梗死区显示红色，A组未发现梗死现象，脑梗死体积为0，B、C 2组均出现不同程度的梗死现象，C组脑梗死体积明显小于B组(P<0.01) (见图1、表1)。

表1 B组和C组小鼠神经功能评分及脑梗死体积比较±s)

2.3 病理学观察

2.3.1 肉眼观察 A组脑组织细胞形态及色泽均与正常细胞一致；B组梗死一侧脑组织肿大，动脉供血区苍白且无光泽，脑组织表面血管颜色较正常者浅；C组症状与B组相比较轻微(见图1)。

2.3.2 HE染色观察 将3组大鼠细胞置于光学显微镜下观察，A组细胞结构与正常细胞一致，且轮廓清晰，有多种形态：锥形、星形、梭形，细胞核为蓝色，细胞质为紫红色，核膜清晰，无坏死细胞；B组神经细胞较少，细胞间隙大，梗死灶周神经元肿大，且呈空泡化，细胞核缩小，细胞间质水肿；C组细胞所有病变情况较B组轻微(见图2)。

2.4 p-JNK、p-ERK表达及凋亡细胞检测 B、C 2组中均有染色显示棕黄色的细胞，即在脑缺血灶周边均存在p-JNK阳性细胞，染色主要出现在细胞核上，少数出现在细胞质上。C组大鼠的脑组织p-JNK表达相对于B组小鼠有所升高(P<0.01)(见图3、表2)；A组小鼠脑组织仅有少数p-ERK阳性细胞，B、C 2组脑缺血灶周边存在大量p-ERK阳性细胞，但C组p-ERK的表达相对于B组较少(P<0.01)(见图4、表2)；A组仅有一小部分的凋亡细胞，B、C 2组在灌注24 h后可以发现大量的凋亡细胞，细胞核均呈棕褐色，主要分布在缺血脑组织，C组相对于B组较少(P<0.01) (见图5、表2)。

表2 p-JNK、 p-ERK表达及凋亡细胞检测

q检验：与A组比较**P<0.01；与B组比较△△P<0.01

3 讨论

近年来，很多新生儿在出生后出现缺血缺氧性脑损伤，其主要原因是新生儿在围生期发生窒息。1%～6%新生儿出现缺血缺氧性脑病，多数新生儿智力发展会受到影响，20%～40%发展为神经功能障碍，患儿会出现癫痫、脑瘫、智力听力障碍或精神出现问题。有多种机制导致这种现象的发生，其中包括氧化应激、细胞凋亡以及兴奋性中毒等，线粒体是有氧氧化和细胞凋亡的关键部位[6-7]。粒细胞集落因子(G-CSF)是一种含有174个氨基酸的糖蛋白，首次发现是在造血细胞中，被认为是造血系统中特异性及其生长因子，可促进中性粒细胞的增殖与分化，鼠G-CSF与人类G-CSF的蛋白序列同源性高达73%，因此一般用鼠进行G-CSF相关实验[8]。G-CSF自发现以来一直用于粒细胞减少的各种病症，G-CSF可以穿过血脑屏障，且在整个过程中可以减缓脑组织缺血或再灌注引起的危害。rhG-CSF是通过基因重组技术产生的，具有保护神经组织的作用，rhG-CSF的神经保护作用主要包含以下几个方面[9-10]：(1)促进骨髓干细胞迁移至脑部受损区域，主动动员骨髓干细胞向病变部位移动，且可穿过血脑屏障使受损的区域转化为神经元；(2)rhG-CSF可以通过JAK/Stat途径引起Bcl-2的过表达，从而抑制神经元的凋亡，另外，可激活ERK1/2，从而进一步提高神经细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡；(3)rhG-CSF可充分抑制T淋巴细胞向中枢神经系统的移动，减少γ-干扰素(IFN-γ)的表达，同时增加IL-4和肿瘤坏死因子(TGF)-β1的表达，最终使炎性作用减少；(4)可促进中枢神经系统多个区域的表达G-CSF，从而产生新的神经元，促进大脑功能的恢复；(5)可以促进脑部血管的生长，增加梗死神经周围血管面积、长度等；(6)促进神经营养因子的分泌。

本研究结果显示，A组的大鼠没有出现死亡现象且神经功能正常；B组的大鼠手术后精神情况不佳、活动少、反应迟缓且进食相对于A组较少，且大鼠的左侧前后肢均不能正常伸展，行走时有向左侧倾斜的趋势，严重者会摔倒；C组大鼠的情况较为正常，明显优于B组。A组小鼠神经功能没有发生损伤，神经功能评分为0分，其余2组小鼠的神经功能均发生不同程度的损伤，B组明显高于C组(P<0.01)。TTC染色结果显示，A组未发现梗死现象，其余2组均出现不同程度的梗死现象，C组明显小于B组(P<0.01)。B组和C组大鼠在脑缺血灶周边均存在p-JNK、p-ERK阳性细胞，染色主要出现在细胞核上，少数出现在细胞质上。C组大鼠的脑组织p-JNK较B组升高(P<0.01)，而p-ERK表达相对于B组有所下降;A组仅有一小部分的凋亡细胞，其余2组在灌注24 h后可以发现大量的凋亡细胞，C组相对于B组较少(P<0.01)。

综上所述，rhG-CSF可以起到保护新生大鼠神经细胞的作用，避免发生缺血缺氧性脑损伤，可能与其调节细胞凋亡相关基因的表达有关。

[1] 张海娇，阴怀清，栗红.神经节苷脂联合参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011,9(5)：576.

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(本文编辑 刘畅)

Effect of recombinant human granulocyte colony stimulating factor on the expression of apoptosis inducing factor in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage

LU Li-juan,XU Mei-jia,DONG Yan

(DepartmentofPediatrics,TheNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999,China)

Objective:To study the effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor(rhG-CSF) on the expression of apoptosis inducing factor(AIF) in neonatal SD rats.Methods:Thirty-six healthy neonatal SD rats with 7 days old were randomly divided into the sham operation group(group A),cerebral ischemia reperfusion group(group B) and drug treatment group(group C)(12 rats each group).The rat cerebral arterial occlusion reperfusion model was made using Longa suture blot method.The group C were injected with drug after two hours and 24 hours of cerebral ischemia,and the other two groups were injected with the same amount of normal saline.At the end of the experiment,the neural function of rat was evaluated by Longa 5 score method,the expressions of extracellular signal regulated protein kinase(p-ERK) and phosphorylated extracellular signal regulated protein kinase(p-JNK) were detected by immunohistochemical method,and the neuronal apoptosis and cerebral infarction volume were detected using Tunel and TTC staining,respectively.The levels of expression and apoptosis of apoptosis related genes were evaluated.Results:A small part of the apoptotic cells in A group and large number of apoptotic cells and brown nuclei in groups B and C after 24 h of reperfusion were found,which distributed mainly around the ischemic brain tissue,and which in C group was less than that in group B(P<0.01).Conclusions:rhG-CSF can protect the neuron of neonatal rat,and avoid the occurrence of ischemic hypoxic brain damage,which is related to the expression of the apoptosis related gene.

brain injury;ischemia and hypoxia;recombinant human granulocyte colony stimulating factor;rat

2015-11-30

上海市高校选拔优秀青年教师专项基金(ZZjdyx12114)

上海交通大学医学院附属第九人民医院 儿科，上海 201999

路黎娟(1984-)，女，主治医师.

1000-2200(2016)12-1545-05

R 364.4

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.002