Maspin基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中表达水平的研究

孙 谦，马国旗，汪庚明，江 浩，周 燕，徐洪波，张亚军，周育夫

·临床医学·

Maspin基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中表达水平的研究

孙 谦，马国旗，汪庚明，江 浩，周 燕，徐洪波，张亚军，周育夫

目的：在mRNA和蛋白水平检测5种不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中Maspin基因表达的差异，探讨Maspin基因与已知转移习性人鼻咽癌细胞株之间的相关性，为鼻咽癌发生转移的可能机制及临床预测转移风险提供理论基础。方法：体外培养SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-2Z、CNE-1、SUNE-1-6-10B 5株不同转移习性的人鼻咽癌细胞株。用RT-PCR及Western blot 2种方法在mRNA和蛋白水平检测5种人鼻咽癌细胞株中Maspin基因表达情况。结果：Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B细胞株均有不同程度表达，差异无统计学意义(P>0.05)，在CNE-2Z细胞株中不表达，且在mRNA和蛋白水平Maspin基因表达具有一致性；Maspin基因在不同转移习性人鼻咽癌细胞株中mRNA和蛋白表达量总体存在差异(P<0.05)，但表达量不随鼻咽癌细胞株转移习性增高而降低(P>0.05)。结论：Maspin基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中mRNA和蛋白表达量不同；Maspin基因可能与人鼻咽癌细胞株的转移潜能无相关性。

鼻咽肿瘤；转移抑制基因；Maspin基因；RT-PCR；Western blot

鼻咽癌是我国高发恶性肿瘤[1]。颈部淋巴结的转移在鼻咽癌早期也很多见，且发生转移率高达60%。局部复发及远处转移是治疗失败的主要原因[2]。随着放疗技术的发展，局部复发明显减少，由于尚未明确鼻咽癌转移机制，远处转移疗效仍无明显提高，因此明确鼻咽癌的转移机制可能是提高鼻咽癌疗效关键步骤。

Maspin(Mammary Serine Protease Inhibitor)基因是1994年ZOU等[3]在用消减杂交技术从乳腺上皮细胞中分离出的，在乳腺正常组织和肿瘤组织中存在差异表达，正常乳腺组织中呈高表达，而在乳腺癌中表达水平明显降低甚至表达沉默。随后大量研究者对其抑制肿瘤转移的机制进行研究，结果发现在多种肿瘤转移过程中Maspin基因发挥抑制作用。通过检索国内外文献尚未发现学者在抑制鼻咽癌转移方面对Maspin基因的研究。本研究通过RT-PCR法在RNA水平和Western blot法在蛋白水平检测Maspin基因在5种不同转移习性人鼻咽癌细胞株[SUNE-1-5-8F(极高转移性) 、SUNE-1和CNE-2Z (高转移性)、CNE-1(中度转移性)、SUNE-1-6-10B(低转移性)]的Maspin基因mRNA表达及蛋白定位和表达是否存在差异，进而明确其与不同转移习性人鼻咽癌细胞株是否存在相关性，为本研究进一步动物实验提供理论基础，争取在明确鼻咽癌转移机制上提供分子生物学基础。

1 材料与方法

1．1 材料 5株不同转移习性的人鼻咽癌细胞株购买于中南大学湘雅医学院中心实验室。本研究主要试剂：RPMI1640培养基，胎牛血清购自HyClone公司；PCR Marst Mix(2×)购自Thermo公司；逆转录试剂盒购自Thermo公司；Marker购自上海生工；WBKLS0100购自底物显色剂购自Millipore公司；Maspin抗体购自Anbo公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-2Z、CNE-1及SUNE-1-6-10B培养于含10%新生牛血清及双抗的1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长至80%融合时，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化进行传代及冻存。

1.2.2 RT-PCR检测Maspin基因mRNA表达水平 (1)RNA的提取及逆转录反应：操作过程按照逆转录试剂盒说明书进行。(2) PCR扩增：Maspin和GAPDH引物用Premier 5.0软件设计；Maspin基因和内参GAPDH引物扩增长度分别为170 bp和258 bp。Maspin和GAPDH在不同的反应管内同时扩增，每种细胞株设3个复孔。按照PCR试剂盒说明书进行操作。(3) RT-PCR结果判定：使用Tanon GIS-3500图像分析软件扫描各目的基因与内参GAPDH产物条带的灰度值。Maspin基因mRNA表达的相对值为各目的基因与GAPDH产物条带的灰度值比值。

1.2.3 Western blot法检测5种细胞株中Maspin蛋白表达 之前实验步骤按文献上步骤进行，最后应用本实验室quantity one软件分析实验所得各组光密度数据。计算公式：相对表达量=各目的蛋白光密度值/相应内参GAPDH光密度值。

1.3 统计学方法 采用单因素方差分析和LSD法。

2 结果

2.1 RT-PCR法在mRNA水平检测Maspin基因mRNA在不同转移习性鼻咽癌细胞中表达水平 在mRNA水平Maspin基因在5株转移习性不同的人鼻咽癌细胞株中扩增量存在差异，在CNE-2Z中不表达，其他细胞株都有不同程度的表达(见图1)。根据管家基因GAPDH值对Maspin基因mRNA的值进行标化，在mRNA水平比较标化后5株不同转移习性鼻咽癌细胞株中Maspin基因表达量有差异(P<0.05)(见表1)。两两比较结果显示，SUNE-1-6-10B组、CNE-1组、SUNE-1组、SUNE-1-5-8F组4组表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，均高于CNE-2Z组(P<0.05)。

分组nMaspin/GAPDH均值FPMS组内SUNE-1-6-10B组30.67±0.04CNE-1组30.73±0.01CNE-2Z组30.00±0.0010.14<0.050.002SUNE-1组30.57±0.05SUNE-1-5-8F组30.61±0.04

2.2 Western blot法在蛋白水平检测Maspin基因在5株鼻咽癌细胞的表达 在本实验室条件下，Maspin蛋白在SUNE-1-5-8F组、SUNE-1组、CNE-1组及SUNE-1-6-10B组细胞株均有表达，而在 CNE-2Z细胞株不表达(见图2)。方差分析和两两比较结果显示，SUNE-1-6-10B组、CNE-1组、SUNE-1组、SUNE-1-5-8F组4组表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，均高于CNE-2Z组(P<0.05)(见表2)。

3 讨论

肿瘤的发生、发展是慢性复杂过程、包括多基因、多阶段、多因素参与调控，转移是恶性肿瘤独有的生物学行为，同时转移也是恶性肿瘤主要致死原因。目前肿瘤防治的主要困难就是无法在肿瘤转移之前找到评估肿瘤侵袭力、转移潜能及预后的指标。在飞速发展的分子生物学的带动下，原癌基因、抑癌基因、转移抑制基因等越来越多的肿瘤基因被发现。研究[4]发现一些转移抑制基因对原发肿瘤生长无抑制作用，而只抑制肿瘤的转移，为了控制肿瘤的转移，更多的了解肿瘤的转移机制，因此对肿瘤转移抑制基因的研究越来越受到关注。

鼻咽癌治疗失败的主要原因是局部复发和转移，随着放疗技术发展及同步化疗的方法兴起，远处转移是目前鼻咽癌治疗失败的主要原因。探讨鼻咽癌远处转移的分子生物学基础，可以为更有效的预防和治疗方法提供理论依据。

Maspin基因是1994年ZOU等[3]用消减杂交技术从乳腺上皮细胞中分离出的肿瘤抑制基因。研究发现其在正常组织中呈现高表达，在肿瘤组织中，随着肿瘤的不断进展其表达也逐渐降低，与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。BEECKEN等[5]通过免疫组织化学和RT-PCR的方法检测了51例膀胱移行细胞癌，发现Maspin基因在浸润癌中表达最少，在浅表膀胱癌中表达量中等，在正常的膀胱上皮中高表达。此外，在食管癌[6]、涎腺肿瘤[7]、黑色素瘤[8]等肿瘤也发现具有肿瘤转移抑制作用。随着对Maspin基因研究的不断深入，发现在一些肿瘤中并非随着其发展而呈降低趋势，如胃癌[9]、脑胶质瘤[10]、胰腺癌[11]等，这种反表达可能与上皮细胞内微环境改变有关，也可能与Maspin启动子的甲基化有关。Maspin蛋白在癌细胞核和核外均有表达，细胞核内的Maspin蛋白表达提示预后较好，细胞质内出现则提示预后不良[12]。MATSUOKA等[13]用免疫组织化学法测定101例肺鳞癌患者Maspin基因的表达和定位，结果显示在无病生存期方面，其预后和淋巴转移及病理分期有着明显的相关性，Maspin基因在细胞质内表达可能是肺鳞癌一个独立的不良预后指标。

目前对Maspin基因抑制肿瘤的可能机制尚不完全清楚，通过大量研究表明可能与以下因素有关：(1) Maspin基因增加细胞黏附。ENDSLEY等[14]研究发现Maspin基因作为纤溶酶原激活剂系统和β1整合素之间的桥梁，有利于细胞的黏附。(2)Maspin基因抑制肿瘤血管生长。SHARMA等[15]研究证实，在乳腺癌组织中VEGF-A和转移相关基因1(MTA1)的表达与Maspin基因表达成反比。(3) Maspin基因诱导细胞凋亡。MAHAJAN等[16]研究也发现Maspin基因作为活性氧物的清除剂，利用半胱氨酸巯基抑制氧化应激和细胞的生长，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

Maspin基因已在多种肿瘤中有抑制肿瘤转移的作用，但随着研究深入发现在细胞质和细胞核中表达作用相反[12]。检索国内外大量文献，暂未发现Maspin基因在鼻咽癌转移中相关作用的研究。本课题利用RT-PCR、Western blot技术检测Maspin基因在5株不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中mRNA和蛋白表达量，结果发现Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B细胞株均有不同程度表达，在CNE-2Z细胞株中不表达，且在mRNA和蛋白水平Maspin基因表达具有一致性。本研究所选用的5株鼻咽癌细胞株都是基础实验中最常用的体外细胞株，已明确其病理及转移习性，国内外学者在放射生物学、放疗敏感性、耐药性及转移机制方面选择作为实验的对象。SUNE-1-5-8F为低分化鳞癌和SUNE-1-6-10B高分化鳞癌，CNE-2Z、SUNE-1为低分化鳞癌，CNE-1为高分化鳞癌，其中SUNE-1-5-8F和SUNE-1-6-10B为SUNE-1的2个克隆亚型。本研究结果发现，Maspin基因在5株不同转移习性的人鼻咽癌细胞株mRNA及蛋白表达量不同；但是Maspin基因在蛋白和mRNA水平的表达具有一致性，在CNE-2Z细胞株中不表达，在其他细胞株都有不同程度的表达，可能是由于Maspin在不同的细胞类型中作用机制不同，有着不同的功能表达，Maspin细胞亚定位也有重要影响，另外Maspin的转录因子和启动子区甲基化都有可能在转录水平调节其表达[17]。Maspin基因在不同转移潜能的鼻咽癌细胞株中的无规律性表达，提示了该基因可能与人鼻咽癌肿瘤细胞株的转移潜能无相关性。CNE-2Z和SUNE-1均为高转移性，CNE-2Z在mRNA和蛋白水平均不表达，可能CNE-2Z细胞株不含有Maspin基因。

肿瘤转移是治疗失败和患者死亡的主要原因，目前恶性肿瘤的治疗所面临的关键在于对肿瘤转移的控制,肿瘤的转移相关基因的研究是今后提高肿瘤疗效的关键环节。本研究证明了Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B细胞株均有不同程度表达，但在CNE-2Z细胞株中不表达，不伴随着细胞株的转移能力增强而降低。Maspin基因在鼻咽癌的转移过程中作用有待进一步研究。

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(本文编辑 刘畅)

Expression of Maspin gene in human nasopharyngeal carcinoma cell line with different metastatic behavior

SUN Qian,MA Guo-qi,WANG Geng-ming,JIANG Hao,ZHOU Yan,XU Hong-bo,ZHANG Ya-jun,ZHOU Yu-fu

(DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To explore the differences of the expression levels of Maspin mRNA and protein in 5 kinds of human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior,and investigate its correlation for providing the theory basis in studying the metastasis mechanism of nasopharynx cancer and predicting clinical risk.Methods:The SUNE-1-5-8F,SUNE-1,CNE-2Z,CNE-1 and SUNE-1-6-10B human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior were cultivatedinvitro.The expression levels of Maspin mRNA and protein in 5 kinds of human nasopharyngeal carcinoma cell lines were detected using RT-PCR and Western blot.Results:The differences of the expressions of Maspin gene in SUNE-1-5-8F,SUNE-1,CNE-1 and SUNE-1-6-10B cell lines were not statistically significant(P>0.05),and the Maspin expression in CNE-2Z cell line could not be detected.The expressions of Maspin mRNA and protein were consistent.The total expression contents of Maspin mRNA and protein in human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior were different(P<0.05),and the expression of which did not change with the increasing of metastatic behavior of cancer cells.Conclusions:The mRNA and protein expressions of Maspin gene in human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior are different,and the Maspin expression maybe be no-correlation with the metastatic potential of nasopharynx cancer cells.

nasopharyngeal carcinoma;metastasis suppressor gene;Maspin gene;reverse transcription PCR;Western blot

2016-06-01

蚌埠医学院科研课题(Byky1376)

蚌埠医学院第一附属医院 放疗科，安徽 蚌埠 233004

孙 谦(1983-)，男，硕士，主治医师.

1000-2200(2016)12-1566-04

R 739.63

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.008