免疫亲和色谱与固相微萃取联用技术研究进展

姚 凯，张 伟，杨琳燕，李 存

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)



免疫亲和色谱与固相微萃取联用技术研究进展

姚 凯，张 伟，杨琳燕，李 存*

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

固相微萃取(SMPE)技术是近年来快速发展的一项样品前处理技术，具有操作简便、经济、快速等优点。SMPE装置由手柄和萃取头两部分组成，萃取头上的涂层是最核心的部分，萃取原理是涂层与目标组分之间的吸附作用。由于涂层的种类有限和选择性差，使其不适合萃取复杂的基质。免疫亲和色谱(IAC)具有很强的特异性。将两项技术联用(IAC-SPME)，抗体或者抗体相关材料作为SMPE的涂层，既有SMPE的优点，又弥补了SMPE在选择性方面的不足，用于直接从复杂基质中萃取分析物，IAC-SPME具有很好的应用前景，是目前研究的热点。论文就IAC-SPME联用技术的研究进展进行了综述。

固相微萃取；免疫亲和色谱；免疫亲和色谱-固相微萃取

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是一项新兴的前处理技术，最大的优点是简化了前处理过程、降低了溶剂的用量。目前SPME使用的商品化涂层在萃取复杂基质中分析物时存在选择性差和萃取时间长等问题。免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography,IAC)是以抗体、抗原特异性的分子识别为基础的色谱技术，拥有很强的特异性和选择性。利用特异性抗体作为SPME的萃取涂层，可以很好的弥补SPME选择性的不足，使其更适合于复杂基质中痕量分析物的萃取，具有广阔的应用前景。本文就SPME与IAC的基本原理以及近年来二者联用的研究进展进行综述。

1 固相微萃取

SPME是一种简单高效的样品前处理技术，此项技术集萃取、浓缩、解吸、进样于一体[1]。被广泛地应用于食品[2-3]、农业[4-5]、环境[6-7]、生物样品[8-9]、临床[10]等领域中的药物残留分析。SPME在继承了固相萃取容易操作和净化效果好等优点[11]的同时，又克服了SPE样品用量大、有机溶剂用量大[12]以及萃取时间长等缺点。

SPME由手柄和萃取头两部分组成，萃取头上的涂层是SPME装置最核心的部分，萃取原理是涂层与目标组分之间的“相似相溶”，极性强的化合物用极性涂层萃取时的效率较高，极性较弱的化合物或非极性化合物用非极性涂层萃取的效果较好。萃取的选择性、灵敏度和萃取容量都是由涂层种类和厚度决定的，目前商品化的SPME涂层种类有限，多数商品化涂层是通过物理方法涂覆在萃取头表面[13]，存在选择性差、不耐高温、对有机溶剂不耐受和使用寿命短等缺点，所以制备更高效、更稳定、选择性更强的SMPE涂层已经迫在眉睫。

2 免疫亲和色谱

IAC是一种利用抗体与抗原性物质特异性可逆结合，实现样本的分离和分析的一项技术[14]。基本过程是将抗体共价结合在惰性基质上制成免疫吸附剂，装柱，用待测组分溶液流经IAC柱，待测组分与抗体特异性结合，杂质则沿柱流下，用适宜的洗脱缓冲液洗脱抗原，得到分离、净化和浓缩后的样品，通过合适的处理与保存，IAC柱可再生使用。目前IAC在农作物检测[15]、兽药残留检测[16]、环境样品检测[17]等多领域得到广泛的应用。IAC具有选择性好、纯化效果好以及可再生利用等优点，使其特别适合作为SPME的涂层。

3 免疫亲和色谱与固相微萃取联用

免疫亲和-固相微萃取(IAC-SPME)使用IAC中的抗体作为SPME的萃取头涂层，既保留了SPME萃取高效和环境友好的优点，又使其拥有IAC强大的识别能力，尤其是适合于复杂基质样品中痕量目标物的萃取。以下从装置形式和制备方法等方面对IAC-SPME联用进行论述。

3.1 免疫亲和-管内固相微萃取

免疫亲和-管内固相微萃取(IAC in-tube SPME)是在毛细管内壁涂覆IAC固定相，通过将样品溶液在毛细管中反复的吸入/流出，使样品中的目标组分萃取富集到固定相中，毛细管可与高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)或液相色谱质谱联用(HPLC-MS)系统相连接，进行分离与检测。

目前报道的IAC in-tube SPME装置制备方法主要为硅烷交联法。此方法用硅烷化试剂将净化后的毛细管或者纤维硅烷化，与含戊二醛的PBS溶液反应，石英纤维表面被活化后，与抗体溶液反应，抗体通过偶联作用紧紧结合在活化表面上。抗体是通过共价键作用结合在活化表面，因此结合更加紧密，使用寿命也更长。

Maria E Q等[18]建立了IAC in-tube SPME/LC-MS测定血浆样品中氟西汀的方法。先将毛细管内壁用食人鱼溶液处理后，3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)进行硅烷化，戊二醛PBS溶液活化，氟西汀抗体偶联到毛细管内壁制备出免疫亲和毛细管。用该毛细管柱萃取血清样品中的氟西汀，解吸所用的流动相为10mL/L冰醋酸乙腈溶液-20mmol/L醋酸铵水溶液(6∶4，V/V)，高纯氮吹干，流动相复溶，LC-MS进行检测。这种方法的定量限(limit of quantity,LOQ)为5.00ng/mL，日内相对标准偏差低于5%，在5.00ng/mL～50.00ng/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.998，此方法所使用的涂层与其他in-tube SPME涂层相比，表现出高灵敏性、高选择性并具有良好的重现性，已被成功用于临床病人血清中氟西汀浓度的测定。

除了可以与LC-MS系统连接之外，还可以与HPLC连接使用。Chavesb A R等[19]用IAC in-tube SPME萃取血浆中的α干扰素，荧光检测器检测。熔融石英毛细管作为免疫亲和柱载体，单克隆抗体作为免疫吸附剂，IAC-熔融石英毛细管的制备参照Maria E Q等[18]方法。对in-tube SPME过程中多项参数进行了优化，优化后的条件为250μL血浆样品用250μL磷酸缓冲液(25mmol/L,pH 6.0)稀释，萃取进行20个流入/排出循环，流速为315μL/min，流动相流经毛细管柱进行动态解吸，解吸所需溶剂体积为50μL。试验结果表明，12次萃取之后，由于免疫吸附剂有损失，IAC-in-tube SPME毛细管的萃取效率也因此降低5%。方法的日间变异系数低于6.2%，在0.006MIU/mL～3.0MIU/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.998，LOQ为0.006MIU/mL，此方法性能明显优于非IAC in-tube SPME。

3.2 免疫亲和-搅拌棒吸附微萃取

免疫亲和-搅拌棒吸附微萃取(immunoaffinity stir bar sorptive microextraction,IAC-SBSME)装置主要为玻璃棒或者状似一支色谱注射器，萃取头是一根涂有IAC的熔融石英纤维或不锈钢丝，为保护萃取头，外套细的不锈钢针管，纤维头可以在针管内伸缩。免疫亲和萃取头的制备方法与IAC in-tube SPME相似，采用硅烷交联法。萃取过程为直接将萃取头浸入样品溶液，在30℃～100℃下，持续搅动15min～60min，然后进行洗脱。

Yuan H D等[20]报道了IAC-SBSME法，用于生物样品中茶碱的分析，将茶碱抗血清作为抗体，APTES和戊二醛进行处理后，共价地固定在熔融的二氧化硅纤维萃取头上。萃取头浸入茶碱标准溶液中室温下用摇床晃动萃取3h，体积为500μL的甲醇-水-三氟乙酸(70∶29∶1，V/V/V)进行解吸。此试验对萃取头和免疫亲和萃取的重现性进行了研究，结果显示用同一萃取头进行5次分析的相对标准偏差为6.1%，当茶碱标准溶液浓度为0.1ng/mL～5ng/mL时，抗原-抗体结合未达到饱和，结合等温线的相关系数为0.968。最后，在血清样品中添加10ng/mL和50ng/mL茶碱，经上述前处理过程后，使用结合等温线成功地对茶碱进行分析，结果显示IAC作为SPME涂层在萃取复杂基质中的药物时，萃取效率与测定结果并不会受到影响，与普通的SPME方法相比更具特异性。

Lord H L等[21]将苯二氮类药物的特异性抗体固定到玻璃棒的表面，第1次制备出用于7-氨基氟硝西泮分析的SPME搅拌棒，建立了IAC-SBSME分离尿液中7-氨基氟硝西泮的方法。参照Yuan H D等[20]提出的方法将抗体固定在搅拌棒上。将搅拌棒放置到样品中萃取30min，500μL甲醇溶液解吸，干燥后，用小体积的流动相复溶后用HPLC-MS/MS来分析。IAC-SBSME在实际检测尿液中7-氨基氟硝西泮时，方法的检测限(limit of detection,LOD)为0.02ng/mL，精密度为1%～27%，定量下限和定量上限之间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2%～10%，方法的线性范围为0.02ng/mL～0.5ng/mL，0.5ng/mL已经接近搅拌棒的柱容量，因此线性范围最大为0.5ng/mL。此方法虽然与其他文献中报道的检测7-氨基氟硝西泮的方法有着近似的检测限，但它的优势在于样品前处理过程更加简单，无论是专业人员或是非专业人员，均可操作。

Lord H L等[22]对Yuan H D[20]的方法进行了改进，将多克隆抗体进行纯化并优化了抗体固定过程，方法LOD为0.001ng/mL～0.015ng/mL，线性范围为0.2ng/mL～2ng/mL，显著降低了苯二氮类药物免疫亲和探针的检出限，并扩大了此方法的适用的线性范围。

Lord H L等[21]成功地证明了IAC-SPME搅拌棒在检测痕量苯二氮药物时的实用性，重点主要放在装置的研发上。Saharnaz S S[23]也进行了研究，主要目的是当把IAC-SPME搅拌棒作为一种广泛使用的工具测定血浆中的药物时，采用来自不同公司、不同物种的抗体作为涂层，搅拌棒性能如何。该研究具有很大的实用价值，因为血浆是制药和毒理学研究过程中最常用的生物样品，研究发现多家公司提供的抗体对3种苯二氮卓药物(安定、去甲安定、去甲羟基安定)的亲和性、容量和交叉反应性都很相似，证明了IAC-SPME是一项从复杂基质样品中萃取小分子很有效的技术。

3.3 免疫磁性微球

免疫磁性微球(immunomagnetic beads,IMB)技术是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一项新技术，具有操作简单、灵敏度高、省时等特点[24]。分离原理是将抗体结合到磁性微球上，得到免疫磁性微球，将其与抗原特异性结合，在外加磁场的作用下，抗原和微球的复合物发生移动，因与其他组分磁反应性不同，故能达到分离抗原的目的。

IMB的制备通常分为两步：首先将制成磁性微球，然后将活性基团引入微球表面，载体表面和抗体发生偶联反应结合到载体上，形成IMB。

IMB由载体微球和免疫配基结合而成。因此载体微球是制备免疫磁性微球最关键的部分，其制备方法主要包括聚合物组合法和单体聚合法。聚合物组合法制备过程简单，但磁性微球大小、粒度、形状均不好控制，而且容易混有杂质，给免疫测定和细胞分离带来了很大困难[25]。

单体聚合法是用引发剂将溶液中单体聚合在磁性微球表面，主要方法有悬浮聚合、分散聚合和乳液聚合(包括乳液聚合、种子聚合)等。得到的磁性微球粒度均匀、形状规则，但微球表面需要经过化学修饰才含有活性功能基团。

Lund H等[26]建立了IMB/LC-MS选择反应检测人血清和尿液中绒毛膜促性腺激素(HCG)的方法，并应用到怀孕的临床诊断中。IBM制备过程如下：1g 磁珠中加入20mg HCG单克隆抗体，1mg磁性微球约含有15μg抗体。抗体在与微球结合之前于酸性条件下(HCl调节至pH 2.5)0℃孵育1h，用PBS缓冲液稀释至10mg微球/mL。微量离心管中加入500μL含50mg/L 吐温-20的PBS缓冲液，再加入20μL覆有单克隆抗体的磁性微球，用振荡器振荡后快速离心，弃上清，离心管中加入1mL样品(血浆或尿液)振荡混匀1h促进微球上的抗体与抗原结合，将离心管放置在磁道上收集磁性微球，洗脱液洗脱磁性微球，将洗脱液用氮气吹干，复溶后用LC-MS进行分析。结果表明，该方法在血浆和尿液中的检测限分别为5IU/L和2IU/L，定量下限分别为10IU/L和5IU/L，血浆中的相关系数大于0.997，尿中的相关系数大于0.999。

Rafalko A等[27]为了提高分析物纯度并减少干扰，将蛋白免疫富集到磁性微球上，LC-MS/MS多反应检测肾癌细胞系中的碳酸酐酶12。将覆有IgG的磁性微球用柠檬酸磷酸缓冲液(pH 5.0)冲洗2次，使用3倍微球体积的含抗碳酸酐酶12多克隆抗体的PBS缓冲液将微球悬浮，室温下将溶液振荡1h，将上清液废弃，磁性微球用0.5mL柠檬酸磷酸缓冲液冲洗2次，0.5mL的PBS缓冲液冲洗3次除去未结合的蛋白，用1倍微球体积的PBS缓冲液将微球重新悬浮。制备好的IMB与肾癌细胞的消解液混合，萃取后用LC-MS/MS检测，结果表明此方法可以对细胞消解液中低至152fmol的碳酸酐酶12进行定量，检测限低至fmol(1fmol=10-15mol)水平，日内RSD≤17%，日间RSD为7.0%～14%。

4 结语

IAC具有很强的选择特异性，SPME具有环境友好、操作简单和经济等优点。两者联用的技术虽然还没有得到广泛的应用，但是抗体作为SPME涂层表现出的优越性已经被人们所认可。IAC、SPME和IAC-SPME联用的优缺点对比，IAC优点：①选择性、特异性强；②净化、富集效果好；③可重复使用。其缺点：①价格昂贵；②对酸碱条件耐受性弱；③需针对目标分析物制备特异性抗体。SPME优点：①操作简单、耗时少；②所需样品量少；③无需溶剂，对环境友好。SPME缺点：萃取头涂层选择性差，无法有效萃取复杂基质中的痕量分析物。IAC-SPME在兼具IAC和SPME的优点的同时，也存在其缺点：①装置形式种类有限；②SPME萃取头上偶联面积小，偶联的抗体量少；③未得到广泛应用。

IAC-SPME可与检测系统联合使用，适用范围很广，拥有极强的富集和净化能力，在复杂基质中进行目标物萃取时有着独特的优势；与传统IAC相比，抗体使用量少，经济节约。但同时存在着一些不足，如抗体固定的方法单一、较难获得性质均一的抗体和柱容量低等，目前报道的IAC-SPME文献多采用硅烷交联法，有待于进一步研究其他的固定方法，所需的均质性抗体随着商品化单克隆抗体的大量生产得到解决。此外，IAC-SPME尚处于探索阶段，报道的装置形式种类有限，发展更多种类简单而且易于操作的萃取装置形式是以后的发展趋势。目前关于IAC In-Tube SPME和IAC-SBSME应用的报道均局限于人类医学领域，未来，IAC-SPME联用技术在农业、食品安全、环境等多领域也会得到研究者的关注，随着技术的不断完善，会逐渐由实验室走向商品化生产。此项技术也有直接与质谱检测技术结合进快速分析的趋势。

[1] 傅若农.固相微萃取(SPME)近几年的发展 [J].分析试验室,2015,34(5): 602-620.

[2] Zhu D S,Li j R,Xu Y X,et al.Changes of volatile compounds in table grapes during postharvest storage by SPME coupled with GC-MS[J].Asian J Chem,2013,25(17): 9647-9652.

[3] Yue J,Zheng Y R,Liu Z M,et al.Characterization of volatile compound in microfiltered pasteurized milk using solid-phase microextraction and GC×GC-TOFMS [J].Int J Food Propert,2015,18(10): 2193-2212.

[4] Mariani M B,Giannetti V,Testani E,et al.Direct immersion-solid phase microextraction for the determination of chlorinated pesticide residues in tomatoes by gas chromatography with an electron capture detector[J].J AOAC Int,2013,96(6): 1430-1434.

[5] Abdulra'uf L B,Tan G H.Multivariate study of parameters in the determination of pesticide residues in apple by headspace solid phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry using experimental factorial design[J].Food Chem,2013,141(4): 4344-4348.

[7] Zhang G J,Liu Z,Zang X H,et al.Solid-phase microextraction with a graphene-composite-coated fiber coupled with GC for the determination of some halogenated aromatic hydrocarbons in water samples[J].J Separ Sci,2014,37(4): 440-446.

[8] Ji X,Li D,Li H,et al.Preparation and application of a novel molecularly imprinted solid-phase microextraction monolith for selective enrichment of cholecystokinin neuropeptides in human cerebrospinal fluid[J].Biomed Chromatogr,2015,29(8): 1280-1289.

[9] Rezazadeh M,Yamani Y,Seidi S,et al.Application of a new nanocarbonaceous sorbent in electromembrane surrounded solid phase microextraction for analysis of amphetamine and methamphetamine in human urine and whole blood[J].J Chromatogr A，2015,29:1-6.

[10] Monteleone M,Naccarato A,Sindona G,et al.A reliable and simple method for the assay of neuroendocrine tumor markers in human urine by solid-phase microextraction-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2013,759: 66-73.

[11] 邱增枝，郑增忍，赵思俊.UPLC-MS/MS法测定猪尿中β2-受体激动剂的基质效应研究[J].动物医学进展，2013,34(9):66-70.

[12] 吴 强，何生虎，陈 娟.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛羊肉中7种β-内酰胺类抗生素的残留量[J].动物医学进展，2015,36(6):64-68.

[13] Ali M,Aziz-Zanjani M O.Advances for sensitive,rapid and selective extraction in different configurations of solid-phase microextraction[J].Trend Anal Chem,2013,51:13-22.

[14] Dzantiev B B,Byzova N A,Urusov A E,et al.Immunochromatographic methods in food analysis[J].Trends Analy Chem,2014,55:81-93.

[15] Sasaki R,Hossain M Z,Abe N,et al.Development of an analytical method for the determination of sterigmatocystin in grains using LC/MS after immunoaffinity column purification[J].Mycotox Res,2014,30(2): 123-129.

[16] 王 清，王国民，郗存显.复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中6种玉米赤霉醇类化合物和氯霉素残留量[J].色谱，2014,32(6):640-646.

[17] Ryu Y R,Reid M J,Thomas K V.Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry with immunoaffinity clean-up for the determination of oxidative stress bipmarker 8-iso-prostaglandin F2alpha in wastewater[J].J Chromatogr A,2015,1409:146-151.

[18] Maria E Q,Eduardo B O.Immunoaffinity in-tube solid phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry for analysis of fluoxetine in serum samples[J].J Chromatogr A,2007,1174(2007): 72-77.

[19] Chavesb A R,Queiroz M E C.Immunoaffinity in-tube solid phase microextraction coupled with liquid chromatography with fluorescence detection for determination of interferonα in plasma samples[J].J Chromatogr B,2013,928(2013): 37-43.

[20] Yuan H D,Wayne M.Biological sample analysis with immunoaffinity solid-phase microextraction[J].Analyst,2001,126：1456-1461.

[21] Lord H L,Rajabi M，Safari S，et al.Development of immunoaffinity solid phase microextraction probes for analysis of sub ng/mL concentrations of 7-aminoflunitrazepam in urine[J].J Pharmace Biomed Anal，2006，40(3):769-780.

[22] Lord H L,Maryam R，Safari S，et al.A study of the performance characteristics of immunoaffinity solid phase microextraction probes for extraction of a range of benzodiazepines[J].J Pharm Biomed Anal，2007，44(2):506-519.

[23] Saharnaz S S.Immunoaffinity solid phase microextraction[D].Canada: University of Waterloo,2007.

[24] 费 枫，黄迅辰.免疫磁珠的原理与特性及其在动物源性食品检测中的应用研究[J].浙江畜牧兽医,2014，39(5)：43-47.

[25] 崔梦楠，田 伟，马素娟.磁性微球在细胞与生物大分子分离纯化中的应用[J].动物医学进展，2014,35(8):74-78.

[26] Lund H,Lovsletten K,Paus E,et al.Immuno-MS based targeted proteomics: highly,specific,sensitive,and reproducible human chorionic gonadotropin determination for clinical diagnostics and doping analysis[J].Anal Chem,2012,84: 7926-7932.

[27] Rafalko A,Fusaro V A,Hancock W,et al.Immunoaffinity enrichment and liquid chromatography-selected reaction monitoring mass spectrometry for quantitation of carbonic anhydrase 12in cultured renal carcinoma cells[J].Anal Chem,2010,82: 8998-9005.

Progress on Combination of Immunoaffinity Chromatography and Solid Phase Microextraction

YAO Kai,ZHANG Wei,YANG Lin-yan,LI Cun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin,300384)

Solid phase microextraction (SPME) is a simple,convenient,economic and fast sample preparation method.Extraction device consists of a holder and fiber,coating is the core of device.The extraction of some complex matrices can be difficult owing to poor range of available coatings and lack of selectivity.Immunoaffinity chromatography(IAC) has a high degree of inherent selectivity,it is combined with SPME by immobilization of the antibody on a fused silica fiber,the resultant IAC-SPME fiber is more convenient to use and is highly selective,permitting the direct extraction of analytes from many complicated matrices.IAC-SPME will become a trend in the development of many aspects.This article introduced the combination of IAC and SPME.

solid phase microextraction;immunoaffinity chromatography; IAC-SPME

2015-07-31

国家自然科学基金项目(31372482)

姚 凯(1991-)，男，内蒙古卓资人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。*通讯作者

S854.4

A

1007-5038(2016)01-0088-05