不同组织上清液对不同间充质干细胞增殖和分化的作用

李鑫，马海英

(中国医科大学 病理生理学教研室，辽宁 沈阳　110000)



不同组织上清液对不同间充质干细胞增殖和分化的作用

李鑫，马海英

(中国医科大学 病理生理学教研室，辽宁 沈阳110000)

[摘要]干细胞与再生医学是当今生命科学最前沿的研究领域。再生医学作为除药物、手术的第3种治疗途径其前景广阔。间充质干细胞由于具备免疫调节功能、多向分化潜能、低免疫原性和无毒副作用等特点，已在临床一定范围开始应用。不同的组织培养上清液对间充质干细胞体外增殖和分化可产生促进或者抑制作用。作者通过比较不同培养上清液对间充质干细胞体外增殖和分化的影响来阐述促进或抑制间充质干细胞体外增殖和分化的经济有效方法、利弊以及对再生医学的意义。

[关键词]间充质干细胞； 生长因子； 再生医学； 文献综述

干细胞是具有自我更新及多向分化潜能的细胞，是组织器官再生的基础细胞，是实践再生医学的最重要先决条件。根据所处的发育阶段和发生学来源，将干细胞分为胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞和生殖干细胞。其中，间充质干细胞是一种非造血成体干细胞，是成体干细胞的一种，分布非常广泛，主要存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血、脂肪等组织中。在特定诱导情况下，间充质干细胞可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等中胚层间充质组织细胞，还可以分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。间充质干细胞具备免疫调节、多向分化潜能的功能，故其能够作为种子细胞应用于修复受损的组织器官。在体外培养中寻找可以促进或抑制间充质干细胞增殖和分化的方法，并将两者综合运用，将给人类解决重大疾病问题带来福音，对再生医学的发展产生重大的影响。

1几种组织上清液对骨髓间充质干细胞体外增殖分化的作用

在间充质干细胞中，骨髓间充质干细胞是最早从人体中提取的，也是研究最早且较为深入、使用最为广泛的干细胞。因此，在体外培养中找到可以促进或抑制其增殖和分化的方法，并且对其优缺点充分利用，对于再生医学的发展具有更为深远的意义。

1.1对骨髓间充质干细胞体外增殖分化起促进作用的组织上清液

目前研究表明，损伤的脊髓匀浆上清液能够诱导骨髓间充质干细胞分泌脑源性神经营养因子、髓鞘前脂蛋白，有利于向神经细胞方向分化[1]。与之相反，破骨细胞破坏后产生的匀浆上清液具有使骨髓间充质干细胞增殖能力降低、成骨分化增强、成脂分化减弱的作用[2]。因此推测，可以利用受损伤组织器官的匀浆上清液来诱导骨髓间充质干细胞的增殖分化，而且这种组织上清液来源丰富，方便了骨髓间充质干细胞的体外培养，对于再生医学来说具有重大意义。

骨髓间充质干细胞在重组腺病毒- 肝细胞生长因子注射液中可以被Ad- HGF高效率的转染，并且可以表达HGF蛋白，而HGF蛋白则可以促进骨髓间充质干细胞的增殖[3]。研究发现，力生长因子(MGF)可以促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，Fn- TPO基因的修饰可以增强人类骨髓间充质干细胞的造血能力[4]。在治疗局部缺血时发现，脑源性神经营养因子可以间接促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞方向分化，从而抑制了病情的发展[5]。因此推测通过控制组织培养上清液中基因的表达和通路或许可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，这使骨髓间充质干细胞体外培养的研究提升到分子水平。研究表明，红景天甙在特定浓度下可以明显促进间充质干细胞的增殖[6]，并且发现在阿糖胞苷存在条件下，红景天甙可能通过调节BCL- 2/BAX的表达来抑制人类骨髓间充质干细胞的凋亡[7]。所以利用红景天甙上清液有望能够快速大量促进间充质干细胞的增殖和分化。

Purmorphamine和胆固醇则可以促进间充质干细胞体外成骨分化[8]，暗示这两种物质可以作为再生医学中的成骨原料。有研究表明，减少饱和脂肪酸的氧化可以减少人类骨髓间充质干细胞的增殖，并且可以导致细胞死亡。有研究[9]表明，饱和脂肪酸可能会长期影响骨髓间充质干细胞在体内的生存。因此，在体外培养中，要注意饱和脂肪酸的影响，趋利避害，达到最佳培养效果。

胎牛血清促进人类骨髓间充质干细胞的增殖是众所周知的。目前研究发现，人富含血小板血清可以作为替代血清促进骨髓间充质干细胞的体外增殖[10]，但是胎牛血清作为目前应用更为广泛的培养基依旧比人富含血小板的血清更适合用于免疫治疗中[11]，因此在应对特殊的临床问题时需要考虑各自的来源问题。研究还发现，KRMBTI血清培养基可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，并且促进其成骨分化[12]。这提示可再生的、耐抵抗的、含有特殊成分的动物血清或人类血清可以作为骨髓间充质干细胞的培养基。 血清资源丰富而且成本低，用这个方法来扩增骨髓间充质干细胞具备极大的优势，研究前景十分广阔。

研究表明，过氧化氢预处理能够通过刺激WJ- MSC产生IL- 6来显著增强WJ- MSC的治疗能力[13]。这种处理方法在治疗心肌梗死时效果十分明显，间充质干细胞通过促进内皮细胞的迁移和增殖增加新血管形成。所以，在体外培养间充质干细胞时，进行过氧化氢预处理可能会达到理想的培养效果，为临床医学带来便利。

在对山羊间充质干细胞的研究中发现，石墨烯可以作为载体，帮助骨髓间充质干细胞进行转移[14]。这项研究结果提示，可以在骨髓间充质干细胞的培养上清液中加入石墨烯，使石墨烯与骨髓间充质干细胞结合在一起用于成骨工程，为成骨带来便利。

无论是哪种促进骨髓间充质干细胞增殖和分化的实验手段，在实验过程中都必须要注意环境因素的影响。研究发现：温和的热力学条件才可以维持骨髓间充质干细胞的增殖和分化[15]；另外在培养上清液中加入利福平后，骨髓间充质干细胞的增殖与利福平的浓度有关系，利福平浓度过高将会明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[16]。

1.2抑制骨髓间充质干细胞体外增殖分化

在骨髓间充质干细胞的体外培养中也存在着影响其增殖分化的种种因素；另外在治疗一些疾病时需要抑制骨髓间充质干细胞的增殖和分化。因此，发现可能会抑制骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的因素并充分利用其优点、避免其可能带来的损失具有重大的研究意义。

通过对小鼠骨髓间充质干细胞的研究发现，铁超载也会损害骨髓微环境，从而影响骨髓间充质干细胞的质量和数量[17]。有数据显示，从年长鼠中提取的骨髓通过调节JNK通路可以抑制其骨髓间充质干细胞的转移，从而抑制其增殖和分化[18]。

同时有研究表明：金黄色酿脓葡萄球菌和表皮葡萄球菌静置产生的碎片和上清液在开始时对骨髓间充质干细胞具有抑制作用，随后的5 d之内，骨髓间充质干细胞开始可以给自己提供保护同时从上清液中获得增殖所需要的营养物质[19]。这种现象说明，骨髓间充质干细胞在体外的增殖分化与在培养上清液中的时间长短有关系，提示了在体外培养骨髓间充质干细胞时要注意培养的时间，以求达到高效率的增殖与分化。

单纯地抑制间充质干细胞的增殖与分化并不都是对疾病的治疗有帮助的。在特定的情况下，抑制其生长反而可以帮助一些疾病的治疗。

2几种组织上清液对脂肪间充质干细胞体外增殖分化的作用

由于脂肪组织丰富且易于获得，利用脂肪组织作为间充质干细胞的来源是非常有吸引力的。针对脂肪间充质干细胞，目前研究表明，组织上清液中的CPA可以显著促进成脂关键基因的表达而抑制了成骨关键基因的表达[20]；而组织上清液中的Choukroun′s PRF可以促进脂肪间充质干细胞的成骨分化[21]，同时，Choukroun′s PRF还可以促进脂肪间充质干细胞在体外大量增殖，但是目前对Choukroun′s PRF的研究还处于初级阶段，还需要进一步的研究和探讨。

3几种组织上清液对脐带间充质干细胞和羊膜羊水来源间充质干细胞体外增殖分化的作用

目前，脐带间充质干细胞因具有几乎不存在伦理争议的优点，被广泛作为间充质干细胞的种子细胞。脐带间充质干细胞在临床医学中的应用对于一些疑难杂症的治疗具有积极的推动意义，促进其在体外大量增殖可能为患者带来极大的福音。

已有研究表明，碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化[22]。目前对于人羊膜羊水来源的间充质干细胞的研究与讨论愈来愈火热。研究发现人羊膜间充质干细胞抑制同种异体淋巴细胞的增殖，减少干扰素的分泌[23]，这表明羊膜间充质干细胞的体外培养对于再生医学中治疗免疫排斥反应具有重大的意义。

4人牙龈上皮细胞上清液对牙髓干细胞体外增殖的影响

人牙髓细胞中含有一定数目的牙髓干细胞，而且牙髓细胞易于获得并培养。在人牙龈上皮细胞上清液中加入四环素对牙髓间充质干细胞的增殖有影响，且与四环素浓度有关。有研究表明，四环素溶液浓度在1%～5%时更加能够促进牙髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[24]。因此，在培养牙髓间充质干细胞时，可以考虑使用1%～5%这个浓度范围的四环素溶液来促进其增殖和成骨分化，缩短培养时间。

5间充质干细胞对再生医学的研究意义及展望

间充质干细胞是最早从人类骨髓中分离出来且应用最为广泛的干细胞。其中骨髓间充质干细胞作为中胚层分化的模型，应用十分广泛。近年来对脐带间充质干细胞和羊膜间充质干细胞的研究越来越精细。目前，研究者[25]已将羊膜间充质干细胞移植于帕金森综合征的动物模型体内，探讨羊膜间充质干细胞的疗效及作用机制。

对间充质干细胞的研究必须同时包括可以促进和抑制间充质干细胞体外增殖和分化的方法，不能单一的促进或者抑制。这是因为在一些情况下某些疾病需要大量扩增间充质干细胞并促进其分化成需要的细胞，而在另外一些的情况下，则需要抑制间充质干细胞的增殖和分化才能够阻止某些疾病病情的进一步发展。因此，综合运用各种促进和抑制间充质干细胞增殖和分化的方法，趋利避害，可以极大地促进再生医学的发展，对于疑难杂症的治愈将产生不可估量的价值，为广大患者带来治愈的希望。

[参考文献]

[1] 刘然，范东艳，金鹏，等.损伤脊髓匀浆上清对骨髓间充质干细胞分泌髓鞘前脂蛋白、脑源性神经营养因子的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(1):7- 11．

[2] 邵秉一，于洋，蒋程程，等.破骨细胞骨吸收上清液对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2014，30(3):241- 244，249．

[3] 哈小琴，董芳，吕同德.肝细胞生长因子基因对BMSCs的修饰及活性观察[J].中国修复重建外科杂志，2010(5)：613- 617．

[4] TONG Y，FENG W，WU Y，et al.Mechano- growth factor accelerates the proliferation and osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells through the PI3K/AKT pathway[J].BMC Biochemistry，2015,16:1.

[5] HE S，SHEN L，WU Y，et al.Effect of brain- derived neurotrophic factor on mesenchymal stem cell- seeded electrospinning biomaterial for treating ischemic diabetic ulcers via milieu- dependent differentiation mechanism[J].Tissue Eng Part A，2015，21(5- 6):928- 938．

[6] 白海，王存邦，马晓慧，等.红景天苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响[J].中国实验血液学杂志，2014(4)：1072- 1077．

[7] 魏玉萍，白海，孙延庆，等.红景天苷对阿糖胞苷诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响[J].中国实验血液学杂志，2013(6)：1572- 1577．

[8] WÖLTJE M，BÖBEL M，HEILAND M，et al.Purmorphamine and oxysterols accelerate and promote osteogenic differentiation of mesenchymal stem cellsinvitro[J].InVivo，2015，29(2):247- 254．

[9] FILLMORE N，HUQI A，JASWAL J S，et al.Effect of fatty acids on human bone marrow mesenchymal stem cell energy metabolism and survival[J].PLoS One，2015，10(3):e0120257．

[10] BERNARDO1 M E，AVANZINI M A，PEROTTI C，et al.Optimization ofinvitroexpansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell- therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute[J].J Cellular Physiol，2007，211(1):121- 130．

[11] GOEDECKE A，WOBUS M，KRECH M，et al.Differential effect of platelet- rich plasma and fetal calf serum on bone marrow- derived human mesenchymal stromal cells expandedinvitro[J].J Tissue Eng Regen Med，2011，5(8):648- 654．

[12] ZHOU D A，DENG Y N，LIU L，et al.Effect of kidney- reinforcing and marrow- beneficial traditional Chinese medicine- intervened serum on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells[J].Exp Ther Med，2015，9(1):191- 196．

[13] ZHANG J，CHEN G H，WANG Y W，et al.Hydrogen peroxide preconditioning enhances the therapeutic efficacy of Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells after myocardial infarction[J].Chin Med J(Engl)，2012，125(19):3472- 3478．

[14] ELKHENANY H，AMELSE L，LAFONT A，et al.Graphene supportsinvitroproliferation and osteogenic differentiation of goat adult mesenchymal stem cells: potential for bone tissue engineering[J].J Appl Toxicol，2015，35(4):367- 374.

[15] CHOUDHERY M S，BADOWSKI M，MUISE A，et al.Effect of mild heat stress on the proliferative and differentiative ability of human mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy，2015，17(4):359- 368.

[16] ZHANG Z，WANG X，LUO F，et al.Effects of rifampicin on osteogenic differentiation and proliferation of human mesenchymal stem cells in the bone marrow[J].Genet Mol Res，2014，13(3):6398- 6410.

[17] ZHANG Y，ZHAI W，ZHAO M，et al.Effects of iron overload on the bone marrow microenvironment in mice[J].PLoS One，2015，10(3):e0120219．

[18] YANG Y M，LI P，CUI D C，et al.Effect of aged bone marrow microenvironment on mesenchymal stem cell migration[J].Age，2015，37(2):16．

[19] RAHYUSSALIM，ANDRIANSJAH，KUSNADI Y，et al.Effect of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis debris and supernatant on bone marrow stromal cells growth[J].Acta Med Indones，2012，44(4):304- 309．

[20] 黄亚斐.Cyclopmine对牛脂肪间充质干细胞的细胞周期及成骨与成脂分化的影响[D].呼和浩特：内蒙古大学，2013．

[21] 刘元媛.Choukroun′s PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究[D].广州：南方医科大学，2013．

[22] 李伟伟，姚星宇，杨丽敏，等.体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究，2014(1):75- 80．

[23] 宋瑾，丛姗，李岩，等.人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖并减少γ干扰素的分泌[J].细胞与分子免疫学杂志，2015(3)：333- 337.

[24] JIN S H，KWEON H，PARK J B，et al.The effects of tetracycline- loaded silk fibroin membrane on proliferation and osteogenic potential of mesenchymal stem cells[J].J Surg Res，2014，192(2):e1- 9.

[25] 陈勇，方宁，陈代雄，等.人羊膜间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的疗效评价[J].中风与神经疾病杂志，2015(5)：406- 410.

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.034

[中图分类号]R329

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)02- 0271- 04

[通信作者]马海英E- mail: 13406949@qq.com

[作者简介]李鑫(1993-)，女，黑龙江嫩江人，在读硕士研究生。E- mail：1040494656@qq.com

[基金项目]国家青年自然科学基金(31200730)

[收稿日期]2015- 10- 20[修回日期] 2015- 12- 11

[引文格式] 李鑫，马海英.不同组织上清液对不同间充质干细胞增殖和分化的作用[J].东南大学学报:医学版，2016，35(2)：271- 274.

·综述·