伤寒沙门菌LeuO调节蛋白研究进展

赵泽慧，李 强，何小丽，李凡飞，许立华

(宁夏大学农学院动物科学系，宁夏银川 750021)

伤寒沙门菌LeuO调节蛋白研究进展

赵泽慧，李 强，何小丽，李凡飞，许立华*

(宁夏大学农学院动物科学系，宁夏银川 750021)

LeuO是伤寒沙门菌复杂调控网络的一个全局转录调节蛋白，其调控伤寒沙门菌许多参与生物过程的基因表达，尤其是可以调控帮助菌体在严苛环境下生存的基因。作为H-NS的备份LeuO根据不同的浓度作为活化剂和抑制剂差异性调节基因表达。LeuO还可诱导孔蛋白的表达，孔蛋白是一种良好的免疫原，当作为疫苗接种动物，刺激机体免疫系统发生免疫应答，产生特异性免疫力。论文重点围绕LeuO作为调节蛋白的调节机制和在免疫学以及其他相关最新研究成果进行综述，以期为该类研究的开展提供参考。

LeuO；伤寒沙门菌；H-NS；孔蛋白

沙门菌(Salmonella)是革兰阴性致病菌，一旦感染可以引起人和动物很高的发病率和病死率[1]。沙门菌通过污染食物和水感染人和动物。大部分的沙门菌血清型经过小肠感染，最终导致宿主自限性胃肠炎；少部分沙门菌血清型可以引起宿主全身感染，如伤寒沙门菌，鼠伤寒沙门菌等。由于沙门菌感染宿主范围广泛，对生存条件要求低，且具有多重耐药性，导致预防沙门菌病非常困难[2]。

革兰阴性菌中大多数细菌外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)均具有抗原特异性。与其他革兰阴性菌一样，沙门菌Omp能刺激易感的宿主产生细胞和体液免疫反应，因而可用于高效价抗体和疫苗的研究开发[3]。在小鼠模型中发现，OmpC和OmpF膜孔蛋白可以引起机体产生长时间抗体反应，产生的特异性免疫力可以保护宿主免受伤寒沙门菌的侵染[4]。除此之外，沙门菌Omp还可以帮助其抵御恶劣的外界环境，嵌入的蛋白质对细菌细胞也具有至关重要的作用，如溶质、蛋白质参与运输和信号转导。

LeuO全局调控涉及细胞多种多样的功能如细菌毒力和菌体的生存。LeuO调节基因表达在沙门菌免疫应答的方面尤其重要，如上所述的菌体外膜孔蛋白。对LeuO的研究不但有助于了解伤寒沙门菌与外界的相互关系尤其是在极端条件下依然生存的机理，而且在免疫学上为开启研发伤寒沙门菌疫苗和作为其他疫苗佐剂成为可能性。本文综述了探究Leuo调节蛋白的过程，调控机制，表达条件以及生物学功能等方面的研究进展，并展望了其在生物技术领域中的应用前景。

1 LeuO调节蛋白

LeuO是原核生物最大转录调节器(LysR-type transcriptional regulators，LTTRs)的成员。LTTRs通过调控菌体基因的表达影响菌体细胞功能，如氨基酸的生物合成、芳香族化合物的分解代谢、抗生素耐药性、氧化应激应答、固氮作用、细菌群体感应以及毒力因子的产生。LTTRs在经典模式中不但可以活化不同基因的转录而且抑制自身的转录。一些LTTRs成员调节自身的表达，还有一些LTTRs的成员调节(激活或抑制)不止一个靶基因。研究普遍认为LTTRs的成员是双重调节子。而LeuO可以作为解除抑制剂，研究表明其具有复杂的与DNA结合的位点[5]。LeuO的低聚物结构是一个四聚体，保证可以与DNA具有高亲和力[6]。

研究LeuO的历史过程曲折而复杂。有关LeuO调节蛋白首次报告指出，leuO基因的位置在leuABCD和ilvIH操纵子之间。由于LeuO的氨基酸序列与LysR家族的成员相似，所以当时将其归为该家族成员。根据leuO基因的定位，研究者推测leuABCD为其操纵子，尽管leuABCD基因缺失株并没有出现LeuO的缺失表现。该报告还阐明LeuO具有转录调节的作用。

LeuO调节蛋白参与细菌恶劣环境条件下与生存相关一些重要基因转录。在H-NS缺失菌株中寻找替代基因时发现，在大肠埃希菌中LeuO过表达可以抑制cadC基因的转录。这个发现使LeuO和H-NS产生联系提供了新观点。H-NS 是一种小组蛋白相似蛋白，广泛存在于革兰阴性菌中。H-NS 不仅参与基因组装配，而且在基因调控中也起关键作用。CadC可以激活cadAB操纵子，这是在酸性条件下菌体表达的重要机制。在研究霍乱弧菌耐酸反应LeuO的作用表明，LeuO是cadC的抑制剂，LeuO的过表达导致了该菌对于有机酸敏感度增加[7]。LeuO还可以通过抑制小调节子Dsr-RNA(在低温的条件下正调控rpoS转录)来减少rpoS基因的转录。而H-NS对cadC和dsrA基因的转录都是抑制作用。有趣的是LeuO对cadAB 操作子以及Rpos基因的转录的抑制都是间接作用。

基于LeuO是双重调节子的研究，在大肠埃希菌中发现LeuO可以正调节bgl和yjjQ-bglj操纵子。而H-NS可以抑制这些基因的表达。说明LeuO具有抵消H-NS效应的作用[8]。bgl操纵子参与一些β-糖苷的利用，而yjjQ-bglj基因编码的转录调节因子是LuxR家族成员。 LuxR 家族调控蛋白是一类在革兰阴性细菌群体感应中起重要作用的调控蛋白，它们参与由酰基高丝氨酸内酯介导的多种生物学过程， 如调控细菌生物发光、 质粒转移、 生物膜形成以及多种胞外酶、 毒力因子和次生代谢产物的合成[9]。

随后一些关于鼠伤寒沙门菌的研究中描述了一个叫顺式作用启动子中转机制模型，其中描述LeuO可以与DNA超螺旋的位点相互作用。在这个复杂的调控机制里，亮氨酸-应答调节蛋白(Lrp)通过ilvIH启动子活化从而引起局部DNA超螺旋的改变，暴露了leuO调节区域。而以上过程的顺利进行都需要leuO的表达。而且，H-NS的结合位点在leuO调节区域内部[10]。

2 沙门菌的调节蛋白LeuO

伤寒沙门菌LeuO的过表达引起了沉默编码OmpS1和OmpS2孔蛋白基因的表达。在大肠埃希菌的研究中表明Leuo调节蛋白扮演着抑制沉默的作用[11]。而且LeuO的浓度差异会影响OmpS1和OmpS2孔蛋白的表达量。当LeuO浓度低的时候，ompS2基因表达；反之，ompS1基因表达时，ompS2表达被抑制。此外，在研究ompS1基因表达过程中发现LeuO具有拮抗H-NS的作用[12]。而到目前为止这种功能尚未在LTTRs其他成员中发现。但别的转录调节子成员，如VirF(AraC/XilS)、RovA(SlyA/Hor)和Ler(H-NS/StpA)在参与调节毒力基因表达时可作为H-NS的拮抗剂。

随后在研究伤寒沙门菌过程中发现，LeuO正调控assT基因而负调控ompX、tpx等基因。这些基因参与多种多样的细胞功能。AssT普遍认为是芳基硫酸盐磺基转移酶，可以将有毒的酚衍生物转化为无毒的化合物，参与解毒过程[13]。OmpX是外膜蛋白(Omp), 缺乏OmpX时提高菌体对于十二烷基磺酸钠和抗生素的耐受性，因而表现影响疏水性化合物的运输[14]。沙门菌具有较强的生物被膜形成能力，在动物饲养环境和肉食品中更易存活，是隐性感染和反复感染的重要原因之一。LeuO负调控Tpx的表达量就是为了菌体在不同pH环境都可以生存[15]。

在研究鼠伤寒沙门菌基因组时，通过使用ChIP-chip,LeuO调节子成员范围扩展到SPI-1和SPI-2上的基因。LeuO调节子由LeuO调节蛋白的编码基因leuO及其调控的基因和操纵子所构成。LeuO特异性结合和对基因的调节主要依靠LeuO的浓度的改变 。另外一个重要发现是LeuO与内含子的结合，因此LeuO很可能作为负调控蛋白抑制基因的转录或作为类核结构的蛋白。LeuO与H-NS和RNA聚合酶多个位点结合的发现确认了LeuO具有拮抗剂作用[5]。

3 LeuO的表达条件

菌体在一般情况下由于H-NS的存在，leuO基因处于静默状态。在恶劣的环境特别是在营养物质短缺的情况下，研究者才在大肠埃希菌和鼠伤沙门菌中检测到了leuO基因的表达。另外，在磷酸盐限制的培养基中也检测到了LeuO的存在。leuO基因的表达不受rpoS调控，即使它的表达需要ppGpp(GDP 或 GTP 的衍生物四磷酸或五磷酸鸟嘌呤核苷)的存在[16]。LeuO对于恢复细胞生长很重要，当缺乏异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸时，细胞生长将延后2 h[17]。研究表明，leuO基因可以被RcsB和BglJ调节子激活[18]。在研究霍乱弧菌时发现ToxR可以激活leuO基因表达帮助菌体对抗胆汁侵蚀[19]。

4 LeuO的生物学功能

4.1 免疫学功能

LeuO在实验室条件下表达量很少，在体内可能主要参与细菌的生存。在小鼠感染模型中，伤寒沙门菌LeuO突变体表现毒力下降。而在霍乱孤菌的研究中，LeuO的缺失导致了生物膜形成的减少。

在小鼠模型中，ompC和ompF的双突变菌株表现毒力下降。OmpC和OmpF孔蛋白介导机体产生持续的抗体，提供对于伤寒沙门菌病的免疫保护。这两个孔蛋白在实验室条件下都可以高水平表达。同样的情况发生在缺乏ompS1和ompS2时，菌株也表现毒力下降。这表明没有LeuO的调节或缺乏OmpS1、mpS2蛋白都会影响细菌生存。leuO基因、ompS1、ompS2沉默基因的缺失引发的菌体毒力下降，表明这些基因可以在体内条件下表达。尽管这些孔蛋白在沙门菌的毒力方面发挥的作用还不是很清楚，但目前的研究都表明这些孔蛋白是溶质、营养物质以及毒素通过细菌外膜的通道。细菌正是因为有了这些孔蛋白得以在不同的环境下尤其是在有药物存在的条件下依然可以生存、繁殖。

研究表明，OmpS1和OmpS2孔蛋白介导小鼠很强的免疫应答，且小剂量的孔蛋白就可为对抗伤寒沙门菌的感染提供显著的保护。这两种保护性抗原在菌体的感染机体过程中表达。这些研究具有相关性，它们为使用这两种蛋白作为抗原开发针对伤寒和其他非伤寒沙门菌的疫苗成为可能性[20]。

4.2 作为H-NS的备选

研究表明，鼠伤寒沙门菌中活化的leuO抑制了SPI-1的转录翻译，从而抑制了菌体侵袭上皮细胞[21]。Espinosa E等[22]研究发现，在有金霉素的环境下表达的LeuO通过HilE抑制SPI-1上基因的表达以及抑制沙门菌入侵上皮细胞。HilE是由非SPI-1编码的调节子，可以抑制hilD的表达。而HilD是由SPI-1编码的正调节转录因子，可以调节SPI-1上其他基因的表达。通过体内使用β半乳糖苷酶融合分析表明LeuO激活了hilE的表达[22]。而通过体外狭线印迹法电泳迁移率以及DNase足迹法分析证实LeuO可以和hilE的启动子区域结合[22]。LeuO抑制SPI-1基因表达可能发生在菌体生长过程中而这时H-NS却不知什么原因不能执行这样的功能。

LeuO作为菌体替代H-NS的备用选择可能有两个意义：一是LeuO可以让沙门菌依然在不良的环境下生存。而这样的条件下SPI-1上基因的表达在细菌生长阶段，细菌显然需要付出更高的成本代价；二是LeuO确保SPI-1基因在菌体侵染肠道时可以按特定顺序恰当表达[21-23]。正因为如此,LeuO可以作为沙门菌H-NS的备用调节子，突出了LeuO作用模式的细微和差异。LeuO的功能就是根据不同的浓度作为活化剂和抑制剂差异性调节基因表达。

5 展望

通过对LeuO调控蛋白的研究，在治疗以及预防伤寒沙门菌病等方面将具有重要意义。LeuO调控机制的深入研究 ,促进人们进一步了解相关抗生素对沙门菌的作用途径和机制, 为沙门菌类疾病的治疗研究提供分子生物学方面的理论依据。当然需要在极端环境或在leuO过表达的条件下探究其功能，直到现在仍没有发现与LeuO相同的诱导物，这些都是未来需要研究的课题。

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Advance in LeuO Transcriptional Regulator ofSalmonellatyphi

ZHAO Ze-hui，LI Qiang，HE Xiao-li，LI Fan-fei ，XU Li-hua

(SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China)

LeuO,as a transcriptional global regulator,is part of a complex regulatory network. It regulates the expression of genes involved in multiple biological processes，and specifically contributes to regulate expression of genes that help bacteria to survive stress conditions. LeuO could act as a backup regulator for H-NS，and as an activator or as a repressor depends on its concentration to regulate differential gene.It also can induce the expression of porins that have been shown to be immunogens and can be considered as antigenic candidates for vaccines.The porins can induce the host immune response and provide protective immunity toSalmonellainfection. Based on the recent research, the focus on the LeuO a transcriptional regulator in regulatory mechanism and immunology was summarized to provide new ideas for conducting such research in this review.

LeuO；Salmonellatyphi；H-NS ;porins

2016-05-27

宁夏“优质高产奶牛遗传改良与选育”专项(2013NYYZ0501)

赵泽慧(1990-),女,山西晋中人,硕士，主要从事预防兽医学研究。 *通讯作者

S852.612

A

1007-5038(2016)12-0086-04