蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子研究进展

杜艳芳, 周金林

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子研究进展

杜艳芳1,2, 周金林2*

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

蜱是以吸血为生的体外寄生虫，能传播多种病原体。控制蜱的传统方法是使用杀虫剂，但会产生药物残留等问题。为了找到控制蜱及蜱传病的新方法，必须在分子水平上了解蜱的相关生理过程。蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子是一类抗蛋白酶分子，主要作用于半胱氨酸蛋白酶的抑制调控。论文介绍了蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子的结构和分类，以及在蜱的吸血、血液消化、蜱的先天免疫及对宿主免疫调节等生理过程的重要作用，同时也综述了半胱氨酸蛋白酶抑制分子具有抗寄生虫和抗癌的作用，为全面了解蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子提供参考。

蜱；半胱氨酸蛋白酶抑制分子；分类；功能

蜱(tick)是一类以吸血为生的蛛形纲体表寄生虫，蜱总科包括硬蜱科、软蜱科和纳蜱科。蜱不仅能传播细菌、病毒、螺旋体和原虫等多种病原体，还能传播森林脑炎、出血热、Q 热、梨形虫病等疾病。蜱及蜱传病严重影响动物和人类的健康，并对畜牧业造成巨大的经济损失。目前控制蜱传统方法是使用化学杀虫剂，但会产生环境污染、肉制品和奶制品的残留及耐药性等诸多问题[1]。为了找到控制蜱及蜱传病的新方法，要在分子水平上了解蜱的相关生理过程及病原传播机制。蜱半胱氨酸蛋白酶抑制分子(cystatin)主要作用于半胱氨酸酶的抑制调控，涉及蜱的饱血、调节血液消化、蜱的先天免疫及对宿主免疫调节等很多重要生理过程。此外，半胱氨酸蛋白酶分子在致病性寄生虫的入侵和细胞内生存发挥重要作用。研究表明，化学类半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有抑制梨形虫生长、治疗克氏锥虫和疟原虫的作用。蜱的cystatin 由于对半胱氨酸蛋白酶抑制活性，可以推测作为抗寄生虫等新型生物药物的研发线索。此外，蜱cystatin具有显著的抑制哺乳动物组织蛋白酶S和L的抑制活性，而组织蛋白酶S和L在肿瘤细胞的侵袭和转移中有重要作用，因此，蜱的cystatin 也可作为抗癌生物药物研发的候选分子。

1 Cystatin的结构和分类

Cystatin家族是一类与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶以及天冬酰胺内肽酶发生可逆、紧密结合抑制的蛋白[2]。cystatin分布于脊椎动物、无脊椎动物、植物及原生动物等绝大多数生物体,它们参与许多生理过程，如抗原呈递、体表稳态、免疫系统发育、炎症反应中的中性粒细胞的趋化性、吞噬细胞退化、细胞凋亡、肿瘤细胞增殖及病原体入侵。一般来说,cystatin分子的保护功能是在正常细胞溶酶体肽酶偶尔释放，或入侵生物时进行保护。cystatin分子还能抑制肿瘤细胞的生长、入侵和转移，如来源于蛇毒的cystatin分子SV-cystatin能抑制小鼠黑色素瘤细胞和人胃腺癌细胞的入侵和转移[3]。

根据保守氨基酸序列和所含cystatin结构域的个数将cystatin分为4个亚家族,即cystatin家族1(stefins家族)，cystatin家族2，cystatin家族3(kininogens家族)，cystatin家族4(cystatin样蛋白)[4]。最近，一个新的分类被提出，即根据MEROPS分类系统中独有的识别码对酶及酶的抑制剂分类。根据MEROPS分类系统，cystatins属于I25家族，此家族被进一步划分为几个亚家族，I25A (stefins), I25B (type 2 cystatins and kinogens)和I25C (fetuins, histidine-rich proteins)。在这篇综述中，依然使用的是传统分类而不是MEROPS分类。在蜱上被发现和研究的主要是cystatin家族1和cystatin家族2 分子。

1.1 Cystatin家族1

Cystatin家族1蛋白是分子质量约11 ku的细胞内蛋白，无信号肽，缺乏二硫键和糖基侧链。cystatin家族1蛋白具有包含1个N端保守甘氨酸和2个β折叠发卡环(发卡环1和2)的结构域，发卡环1含有一个QXVXG保守氨基酸序列。

第1个cystatin家族1蛋白发现于人的多形核白细胞的细胞质，命名为 cystatinA。cystatinA的表达有限，特别是在人的皮肤和血液细胞。在皮肤中的蛋白参与表层屏障的形成。另一个家族1 cystatin蛋白在人的肝脏中发现，命名为cystatin B。cystatin B广泛分布在哺乳动物的不同组织和细胞中，能与组织蛋白酶B、L、S、H产生紧密结合抑制。在各种脊椎动物(鼠、兔、猫、牛和猪等)、无脊椎动物(水蛭等)以及寄生虫(线虫类等)均发现人的cystatin A和cystatin B的同系物存在，它们参与调节蛋白的水解过程。由于寄生虫(线虫类等)cystatin分子作用的靶酶在免疫调节体内的平衡机制中发挥作用，其可能在调节寄生虫和宿主相互关系中有重要作用。如大片吸虫(Fasciolagigantica)的家族1 cystatin 分子Fg-stefin 1(登录号：ACS35603)能抑制哺乳动物组织蛋白酶B、L和S的活性以及大片吸虫的半胱氨酸蛋白酶活性，推测其可能通过调节细胞外的蛋白水解来保护肠道和体表[5]。

1.2 Cystatin家族2

Cystatin家族2蛋白是分子质量约为13 ku～15 ku的分泌型蛋白，有2个分子内二硫键桥和1个信号肽。与家族1的cystatin相同，具有一个包含N端保守甘氨酸和两个β折叠发卡环(发卡环1和2)的结构域，且发夹环1同样也有QXVXG保守氨基酸序列，但发卡环2上却有一个PW保守氨基酸序列，如人cystatin C(登录号：P01034)。

典型的家族2 cystatin是20世纪60年代从鸡蛋清中分离到的，由于具有抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，最早被命名为“cystatin”。人cystatin C作为一种“紧急”抑制分子分布在各个地方，能清除释放到体液的任何半胱氨酸蛋白酶。近年来，cystatin C在肿瘤中的作用以及在肿瘤浸润、转移中的作用得到广泛研究，cystatin C能抑制肿瘤细胞的生长、入侵和转移。在寄生虫中家族2 cytatin分子比家族1研究的更为广泛。如，日本血吸虫(Schistosomajaponicum)的cystatin分子Sj cystatin能诱导巨噬细胞的极化，并可作为炎症反应药物来源[6]。

1.3 Cystatin家族3

Cystatin家族3蛋白是一类分子质量为60 ku～120 ku的分泌型蛋白，具有多个结构域。家族3 cystatin有3个家族2 cystatin结构域，后2个结构域有抑制活性。cystatin 3主要功能是保护机体不受溶酶体半胱氨酸蛋白酶和侵入的病原体所释放的蛋白酶的危害。

1.4 cystatin家族4

Cystatin家族4是由胎球蛋白和组氨酸糖蛋白组成的分泌型蛋白，具有两个结构域，但对半胱氨酸蛋白酶无抑制活性。

2 蜱cystatin功能

2.1 蜱cystatin在蜱的生物学活动中的作用

蜱cystatin分子在蜱的生物学活动中十分重要，cystatin分子涉及蜱的饱血、胚胎发育、调节血液消化、对宿主免疫调节及蜱的先天免疫等很多重要生理过程。近年来，许多种不同硬蜱和软蜱的半胱氨酸蛋白酶抑制分子被鉴定，并进行了生化分析确定其在蜱的生理和血液消化中的作用[7]。

2.1.1 家族1蜱cystatin在蜱的生物学活动中的作用 家族1蜱cystatin可能在蜱的胚胎发育中起作用。微小牛蜱(Boophilusmicroplus)的cystatin分子Bm cystatin (登录号：ABG36931)属于cystatin家族1，Bm cystatin虽不能抑制木瓜蛋白酶的活性，但却能有效抑制人组织蛋白酶L和来源于微小牛蜱的卵黄素降解半胱氨酸蛋白酶VTDCE的活性。Bm cystatin在微小牛蜱的脂肪体和卵都能表达，推测其功能不止一种，如在微小牛蜱的卵表达的Bm cystatin可能在微小牛蜱的胚胎发育中起作用[8]。镰形扇头蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)的家族1 cystatin分子RHcyst-1能抑制组织蛋白酶B、C、H、L、S以及木瓜蛋白酶的活性，其中对组织蛋白酶S抑制活性最高，其次为组织蛋白酶L，对组织蛋白酶B的抑制活性最差。通过实时荧光定量PCR测定蜱的不同发育阶段(卵、幼蜱、若蜱、成蜱)的RHcyst-1表达量，发现其在卵中表达量最高，同时RHcyst-1基因沉默后会显著降低产卵率，推测RHcyst-1可能参与蜱的早期胚胎发育[9]。

家族1蜱cystatin可能在调节蜱的血液消化中起作用。长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)的家族1 cystatin 分子Hlcyst-1能有效抑制木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L的活性。Hlcyst-1定位在蜱的中肠上皮细胞HLCPL-A(长角血蜱的一种组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶)周边。HLCPL-A可能在消化血红蛋白中起作用，而HLcyst-1能够调节HLCPL-A对血红蛋白的降解[10]。家族1蜱cystatin可参与宿主的免疫调节。Bmcystatin不仅参与胚胎发育，Bmcystatin-like蛋白在唾液腺中被鉴定，其可作为一个防御蛋白或调节宿主免疫。

2.1.2 家族2蜱cystatin在蜱的生物学活动中的作用 家族2蜱cystatin在蜱的血液消化中有重要作用。镰形扇头蜱的家族2 cystatin分子RHcyst-2能有效抑制组织蛋白酶S活性，对L也有较高抑制活性,但对组织蛋白酶B的活性较差。RHcyst-2在蜱的中肠中大量表达，在蜱的唾液腺、卵、脂肪体中也有少量表达，但是在所有的器官中的表达都是吸血与未吸血的蜱相比，RHcyst-2明显上调表达[11]，所以RHcyst-2在蜱的吸血过程中有重要作用。肩突硬蜱(Ixodesscapularis)的家族2 cystatin分子sialostatin L和sialostatin L2都在蜱的吸血过程中起关键作用。尤其是sialostatin L2，在蜱吸血过程中，在唾液腺内高度上调表达。sialostatin L和sialostatin L2基因沉默后会显著降低饱血重量[12]。3个长角血蜱的家族2 cystatin分子HLcyst-2，HISC-1，HLcyst-3均能抑制木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L的活性，都在蜱的吸血过程中发挥作用。HLcyst-2在蜱的中肠和血细胞中大量表达。Hlcyst-2基因在蜱吸血过程的前4 d表达上调，随后都呈下调趋势[13]。HLcyst-2能调节血红蛋白消化，由于它与HLcyst-1一样能有效抑制HICPL-A的活性。HISC-1主要在长角血蜱的唾液腺的2型腺细胞中，HISC-1在蜱吸血的早期阶段(24 h)表达上调，随后表达下调[14]。HLcyst-3主要在蜱的中肠中表达，与HLcyst-2相似，HLcyst-3能够调节中肠内的半胱氨酸蛋白酶以及调节血红蛋白的消化[15]。非洲钝缘蜱(Ornithodorosmoubata)的家族2 cystatin分子Omcystatin-1，Omcystatin-2能抑制组织蛋白酶B、L、S、H、C的活性，Omcystatin-1在蜱的中肠中可检测到，在蜱吸血24h后在所有的蜱组织中两个基因的表达都高度上调，但在中肠中Om-cystatin 1的表达水平明显低于Om-cystatin 2。Om-cystatin 2在中肠，唾液腺的2型腺细胞中均被发现，可推测其可能通过释放到中肠内腔来调节蜱的血液消化[16]。微小牛蜱的家族2 cystatin分Rmcystatin-3在蜱的脂肪体、唾液腺表达，但主要在与免疫相关的血细胞中表达[17]。Rmcystatin-3能抑制组织蛋白酶L、B和BmC1-1(微小牛蜱中肠的半胱氨酸蛋白酶)的活性，表明其在蜱的血液消化中的作用[18]。

家族2蜱cystatin在蜱的免疫中有重要作用。HLcyst-2除影响蜱对血液的消化外，还会影响蜱的先天性免疫。长角血蜱的成蜱注射LPS以及若蜱注射梨形虫后Hlcyst-2基因显著表达上调。 具尾扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus) cystatin分子Ra-cyst-1被认为是一种家族2 cystatin,Ra-cyst-1在中肠表达，通过实时荧光定量PCR检测，并未在唾液腺中发现，同时，通过免疫印迹分析，发现感染蜱时Ra-cyst-1并不会分泌到宿主细胞内，推测其可能参与中肠的调节或吸血过程中的自身免疫[19]。Omcystatin-2除调节血液消化外，与Omcystatin-1一样，都能影响T细胞和树突细胞的增殖和细胞因子的释放。Rmcystatin-3除了调节血液消化外，由于其主要在蜱的血细胞中，且在大肠埃希菌感染时，Rmcystatin-3表达下调，推测其在蜱的免疫调节中有重要作用。利用小鼠感染伯氏疏螺旋体模型研究sialostatin L和sialostatin L2对树突细胞的影响。sialostatin L通过抑制恒定链在树突状细胞中的加工，影响树突细胞的成熟，从而影响适应性免疫反应。而sialostatin L2影响炎症反应中的趋化因子的产生[20]。

此外，家族2蜱cystatin可能在抗原传播中有重要作用。Hlcyst-3除具有和Hlcyst-2相似的功能外，它同样可成为来源于宿主的血液或病原体的cystatin分子，而longipain(长角血蜱中鉴定出的一个木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶)在病原传播中起到重要作用，所以推测Hlcyst-3通过对longipain的调节在病原传播中起重要作用[23]。

2.2 Cystatin抗原虫的作用

半胱氨酸蛋白酶被认为可作为抗原虫药物的作用靶标。cystatin分子通过抑制原虫体内的半胱氨酸蛋白酶，从而抑制原虫的生长。疟疾是由疟原虫引起的疾病。恶性疟原虫的半胱氨酸蛋白酶在降解宿主血红蛋白的过程中起重要作用，半胱氨酸蛋白酶palcipain-2和falcipain-3在红细胞内期的功能是降解宿主的血红蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64和ALLN能在疟原虫细胞内阻断这两种蛋白酶的加工。

锥虫病是由锥虫属中鞭毛类寄生虫引起的，如果抑制了锥虫体内的半胱氨酸蛋白酶，就抑制了锥虫的生长、繁殖。锥虫中，chagasin的变化(ICP水平变化)与哺乳动物宿主感染性相关，这与寄生虫的酶的活性相关的内源性寄生虫半胱氨酸蛋白酶的改变有关。缺乏ICP会增加感染和分化，而其表达的增加降低了无脊椎动物宿主的宿主细胞入侵和增殖[21]。来源于骚扰锥蝽(Triatomainfestans)中肠的半胱氨酸蛋白酶抑制分子Tigutcystatin主要在前中肠表达，实时荧光定量PCR表明经克氏锥虫感染时Tigutcystatin mRNA显著上调。这些结果都表明Tigutcystatin可能通过抑制寄生虫的半胱氨酸蛋白酶参与锥虫肠道调节[22]。梨形虫病是经蜱传播的一种红细胞内寄生性血液原虫病，梨形虫代谢途径中的半胱氨酸蛋白酶被认为可作为抗梨形虫药物的作用靶标。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64和ALLN具有抑制牛梨形虫生长的作用，E64能显著地抑制寄生虫入侵宿主红细胞的作用，ALLN能抑制染虫红细胞内的寄生虫的繁殖。进一步研究发现，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64、ALLN和亮抑酶肽等同样能抑制双芽梨形虫半胱氨酸蛋白酶BbiCPL1的活性[23]。长角血蜱的若蜱注射吉氏梨形虫后Hlcyst-2基因显著表达上调，同时Hlcyst-2能显著抑制体外培养的梨形虫的生长，并能在形态学上发生变化。

弓形虫是专性细胞内寄生虫，会入侵到许多细胞，蛋白酶在弓形虫的入侵宿主细胞有重要作用，通过蛋白水解酶水解并释放细胞黏附分子是弓形虫入侵宿主细胞必须的一步。有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂能抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，阻止弓形虫入侵到宿主细胞，导致弓形虫体某些生物活性丧失，甚至发生代谢障碍，发育受阻和形态改变等。研究发现，半胱氨酸蛋白酶抑制剂LHVS和ZL3VS能有效抑制弓形虫微线体分泌、迁移和细胞入侵[24]。

2.3 Cystatin抗肿瘤细胞的作用

以蛋白水解酶为靶点研制抗肿瘤侵袭药物是当前较为成熟的方向。cystatin能通过抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。cystatin M 和 cystatin C的表达能抑制肿瘤的入侵和转移。cystatin M 的表达下调或缺失与乳腺癌的侵袭和转移能力有密切关系，体内外实验研究发现，促进cystatin M 的表达可显著抑制乳腺癌细胞(MDA-MB-435S) 的侵袭和转移;接种cystatin M的MDA-MB-435S 细胞的裸鼠的原发瘤生长及肺脏肝脏的转移受到抑制。cystatin M/E能通过抑制细胞内外组织蛋白酶L的活性导致子宫颈癌生长受到抑制，侵袭转移能力下降[25]。cystatin C可作为p53的诱导凋亡介体，调节组织蛋白酶的活性。在p53突变的乳腺癌细胞，cystatin C的表达显著下调[26]。近年来相关研究发现，不仅人cystatin重组蛋白在肿瘤的侵袭和转移中有抑制作用，来源于蛇毒的cystatin分子(sv-cystatin)也能抑制肿瘤细胞的生长、入侵和转移。重组腺病毒sv-cystatin可以在体内外抑制B16F10细胞的生长、入侵和转移；采用实验性肺转移实验模型发现，sv-cystatin重组蛋白在小鼠体内也有一定抑制率[27]。蜱cystatin由于具有很高的对组织蛋白酶L、S的抑制活性，而组织蛋白酶L、S在肿瘤细胞的侵袭和转移中有重要作用，推测蜱cystatin 对肿瘤细胞有一定的抑制作用。

3 展望

本文介绍的蜱的13种cystatin分子的功能，它们在蜱的吸血、宿主免疫调节及蜱的自身免疫等方面有重要作用，蜱cystatin分子的研究对于了解蜱的相关生理过程及病原传播机制具有十分重要的意义。通过实时荧光定量PCR分析和RNA干扰技术发现很多蜱的cystatin分子在蜱的吸血过程中有重要作用。如RHcyst-2在蜱的中肠中大量表达，吸血后RHcyst-2明显上调表达，sialostatin L2在唾液腺内高度上调表达，基因沉默后会显著降低饱血重量。此外，Rmcystatin-3大肠埃希菌感染后Rmcystatin-3基因表达下调，以及长角血蜱的成蜱注射LPS以及若蜱注射梨形虫后Hlcyst-2基因显著表达上调，都预示着蜱cystatin 分子可能参与免疫调节作用。

半胱氨酸蛋白酶被认为是一个十分有前途的抗寄生虫靶。已有研究表明化学类半胱氨酸蛋白酶抑制剂能抑制梨形虫生长、治疗锥虫和疟原虫。蜱的cystatin 分子对哺乳动物半胱氨酸蛋白酶的显著的抑制活性，可以发挥与化学制剂类似作用，因此，通过活性位点的改造，以及蛋白分子递药方式和发挥效能的研究，可能成为开发新型的抗寄生虫生物药物的重要分子。此外，已鉴定的蜱cystatin分子中大多都能抑制哺乳动物组织蛋白酶S和L的活性。组织蛋白酶S和L被认为是有效控制肿瘤细胞的靶标，因为它们在肿瘤细胞的入侵和转移中有重要作用。所以，蜱cystatin分子有望作为新型抗癌药物的研发线索。参考文献:

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Advance in Inhibitory Molecules of Cysteine Protease of Ticks

DU Yan-fang1,2, ZHOU Jin-lin2

(1.CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai, 200234,China;2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai, 200241,China)

Ticks are a kind of hematophagous ectoparasites, transmitting a variety of pathogens. Using pesticide to control ticks is the traditional way, but it brings problem such as drug residues.In order to find new ways to control ticks and tick-borne diseases,we must understand the physiology processes of ticks at the molecular level. Tick cysteine protease inhibitors are a kind of molecules against protease and play a major role in the regulation of inhibiting cysteine enzyme.This paper introduced the structure and classification of tick cysteine protease inhibitors, as well as the important function in physiological processes such as blood-sucking, blood digestion, tick innate immunity and host immune regulation, and also reviewed the cysteine protease inhibitory molecules that have effects on anti-parasites and anti-cancers, which provide information for the comprehensive understanding of tick cysteine protease inhibitory molecules.

tick;cysteine protease inhibitor;classification;function

2016-04-28

国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(2015CB150300)

杜艳芳(1992-)，女，山西忻州人，硕士研究生，主要从事动物学研究。 *通讯作者

S852.746

A

1007-5038(2016)12-0095-05