白假丝酵母菌生物膜的形成及耐药机制研究进展

刘林波，李亚婷 综述,郭瑞林 审校

(陕西中医药大学：1.医学技术系；2.第二附属医院检验科，陕西咸阳 712000)

·综述·

白假丝酵母菌生物膜的形成及耐药机制研究进展

刘林波1，李亚婷1综述,郭瑞林2△审校

(陕西中医药大学：1.医学技术系；2.第二附属医院检验科，陕西咸阳 712000)

关键词:白假丝酵母菌；生物膜；耐药机制

1976年Marshall第一次提出了生物膜的概念 ，指出“生物膜是生长于细菌表面非常细的外聚合物纤维”。时至今日，人们对生物膜的研究取得了新的进展和认识，新的定义指出生物膜是微生物群落为了自我保护而产生的一种附着于组织表面、由其自身产生的细胞外基质(ECM)包裹的细胞菌群的一种形态。自然界中微生物主要是以生物膜的形式存在，65%～80%的人类感染性疾病与生物膜相关[2]。临床上生物膜广泛存在于各种介入性医学材料表面，诸如支架、分流器、气管内插管、起搏器、其他植入物等。调查显示60%的ICU患者患有的生物膜相关感染均由使用导管引起[3]，其中白假丝酵母菌是导管相关感染的第三大原因，占总感染率的第2位，病死率的第1位[4]。因此，对白假丝酵母菌生物膜的形成及其相关基因、耐药机制以及预防与治疗的研究非常重要。

1白假丝酵母菌生物膜的形成及其相关基因

1.1白假丝酵母菌生物膜在体外形成的4个阶段白假丝酵母菌生物膜在体外形成大致可以分为4个阶段：(1)以酵母细胞形式黏附于各种介质表面；(2)酵母细胞沿介质表面生长增殖形成一层基底层细胞；(3)酵母细胞转变为菌丝相，大量菌丝的生长伴随着细胞外基质(ECM)的产生，逐渐形成成熟的生物膜；(4)脱落的酵母细胞作为种子传播，形成新的生物膜。ECM作为生物膜重要的组成部分，为细胞的聚集和黏附提供一个支架并维持生物膜的结构，同时也是细胞吸收水分和营养的必经通道。组成ECM的主要大分子物质有：55%的蛋白质、25%的碳水化合物、15%的脂质和5%的核酸。其中碳水化合物主要包含3种多糖：(1,6)-甘露聚糖占87%、(1,6)-葡聚糖约13%、而(1,3)-葡聚糖只占很小一部分，脂质中中性甘油糖脂占89.1%、极性甘油糖脂10.4%、鞘脂类0.5%[6]。

体外研究表明，影响白假丝酵母菌生物膜形成常见的因素有(1)血清、温度、pH值、CO2的影响：加入血清和升高温度(37 ℃)可以促进其菌丝的生长；当环境pH>6.5时可发生酵母相到菌丝相的转变；5%的CO2对菌丝生长也有促进作用[7]。(2)培养基的影响：比较RPMI-1640培养基和YNB(无氨基酵母氮源)培养基对白假丝酵母菌生物膜形成的影响，发现生物膜在RPMI-1640中生长较厚，而在YNB中仅表现为粘连，不能形成多层结构的生物膜[8]。(3)氨基酸代谢：脯氨酸和蛋氨酸与G耦联蛋白受体GPR1结合激活cAMP-PKA途径，促进其由酵母相向菌丝相转变[9]。(4)附着层材料的影响：Hawser等[10]比较不同导管材料对白假丝酵母菌生物膜形成的影响发现，乳胶和硅酮弹性体相比聚氯乙烯(PVC)上形成的生物膜略有增加，而在聚氨酯和100%的硅胶上形成的生物膜显著下降，即使是同一种材料不同厂家也会有差别。(5)群体感应系统也会影响生物膜的形成：法尼醇是真核细胞中发现的第一个群体感应分子，它可以抑制白假丝酵母菌由酵母相向菌丝相转变，但法尼醇的存在会影响T细胞的增殖，造成真菌的细胞免疫逃逸[11]，因此法尼醇对机体的作用具有两重性。

1.2白假丝酵母菌生物膜形成相关基因白假丝酵母菌为双相菌，正常情况下一般为酵母相，致病时转化为菌丝相。其生物膜形成最重要的毒力因子就是黏附宿主细胞和菌丝的形成。在黏附宿主细胞的过程中不同时间段表达的黏附因子不同，诱导早期生物膜形成的黏附因子有ALS1、ALS2、ALS3、ALS4、EAP1、MSB2、PGA6、SIM1、ORF19.2449和ORF19.5126，其中PGA6、ORF19.5126、ALS4、ALS2、SIM1、EAP1和ALS1与浮游菌相比表达增加，说明细胞的黏附需要这7个基因[12]。在菌丝形成的过程中，UME6起到了重要作用，它可以增加白假丝酵母菌菌丝的生长，促进其生物膜的形成[13]。

还有一些基因不是直接控制细胞形态变化，而是控制一组目标基因间接的执行特定的功能。该类型的基因目前发现的主要有6个，分别是BCR1、EFG1、NDT80、ROB1、TEC1、BRG1。其中每个基因对其他5个基因都有控制作用，形成一个巨大的网状结构，并间接控制了大约1 000个基因[14]。研究表明，BCR1 通过调控ALS3的过表达从而促进生物膜在体外、体内的形成。在体外，若BCR1/BCR1突变则无法形成生物膜，但人为增加ALS3表达依然可以形成生物膜；若ALS3/ALS3突变则不能形成生物膜。而在体内，这种单纯的调控略有不同，体内存在代偿途径，若BCR1/BCR1突变，不能使ALS3过表达，但会有ALS1、ECE1、HWP1代偿性表达，最终形成生物膜[15]。然而，这6个转录因子并不是对所有酵母菌都有相同的调控作用，如NDT80可调控白假丝酵母菌生物膜的形成，但对酿酒酵母菌只调节其减数分裂[16]。

2白假丝酵母菌生物膜的耐药机制

众所周知，形成生物膜的真菌耐药性明显增加，而要清除成熟的生物膜非常困难。它的耐药模式不排除传统耐药模式如质粒、转座子、个体细胞基因突变等，但也有其独特的耐药机制。目前认为主要有以下3种：ECM延缓药物的渗透；细胞应激反应；耐药基因的出现。

2.1ECM延缓药物的渗透药物进入被生物膜包裹的细胞要通过其形成的ECM，它可以延缓某些药物的扩散，Suci等[17]发现铜绿假单胞菌生物膜可延缓环丙沙星的渗透，未形成生物膜的表面只需要40 s就可以渗透，而渗透成熟的生物膜需要21 min。白假丝酵母菌生物膜也有相似的阻碍作用[18]。然而，不是所有的药物都会出现渗透限制现象，如糖肽类万古霉素和替考拉宁会受到显著的影响，而利福平、克林霉素和大环内酯类不会受到影响或影响较小，这说明ECM对药物的渗透与药物的种类有关。大量研究表明，ECM 的这种抗药性可能与生物膜在形成过程中分泌的葡聚糖有关，其中(1,3)-葡聚糖可隔离氟康唑等进入生物膜[19]。

2.2细胞的应激反应白色念珠菌属于条件致病菌，当它感受到生存环境的变化刺激、传导刺激信号(如温度、pH等)时，就会由酵母相转变为菌丝相生长，而在这个过程中钙调磷酸酶对其刺激信号的传递起到了至关重要的作用，也就是说钙调磷酸酶能让细胞更好的适应生存环境。缺乏钙调磷酸酶的突变株对氟康唑明显敏感[20]。

2.3耐药基因形成生物膜的真菌其耐药相关的主要基因是编码多种药物外排泵的基因和细胞外基质DNA(eDNA)。目前已确定的2种编码多种药物外排泵的转运因子，即ATP结合转运蛋白(ABC)编码的CDR基因(CDR1和CDR2)和易化扩散载体超家族中的多耐药基因MDR1，这两种基因在白假丝酵母菌生物膜的形成过程中表达增加[21]。另外，ECM是白假丝酵母菌生物膜的形成及其耐药的重要原因之一，而eDNA是组成ECM的DNA，它对维持生物膜的完整性至关重要，减少eDNA可以破坏生物膜的构架；相反，添加外源性的eDNA可以促进生物膜的生长[22]。总之，生物膜的耐药机制较为复杂，可能是多种机制共同作用的结果。

3白假丝酵母菌生物膜相关感染的预防与治疗

形成生物膜的真菌具有很强的耐药性和免疫逃逸性，导致许多难治性感染。最近有研究显示，两性霉素B和棘白菌素(卡泊芬净和米卡芬净)对白假丝酵母菌生物膜有着独特的敏感性，且与法尼醇联合作用有更好的效果 。而大剂量的氟康唑与卡泊芬净联合会有拮抗作用[24]，有趣的是，高浓度的氟康唑作用于白假丝酵母菌生物膜后再用卡泊芬净，会导致卡泊芬净的功效显著减低，这可能与高浓度氟康唑介导的Hsp90和钙调磷酸酶产生的细胞应激反应有关[25]。此外，Taff等[26]发现3种葡聚糖修饰酶(BGL2、PHR1、XOG1)对(1,3)-葡聚糖的分泌和胞外基质的形成很重要，缺乏这些修饰酶的基因突变体形成的ECM中葡聚糖含量降低且ECM形成的量减少，对氟康唑的敏感性明显增强，因此，这几种葡聚糖修饰酶的抑制剂可能会成为抗真菌药物的新靶点。

除了药物的治疗，寻找预防白假丝酵母菌生物膜形成的导管性材料也是一条有效的途径。近年发现聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙烯胺为基础的纳米粒子(nanoPEI)可抑制细菌和酵母菌生物膜的形成[27]；Anna等[28]使用中心静脉导管(CVC)插管的小鼠，将卡泊芬净滴入CVC作为预防体内白假丝酵母菌生物膜的新型模型，证明该模型能显著减少生物膜的形成；与此同时，Silva-Dias等[29]发现将硝酸铈(铈为镧系元素)作为医疗导管内涂层，能够有效地防止生物膜相关感染的形成。

目前对白假丝酵母菌生物膜的形成过程已逐渐明了，多种生物膜形成的相关基因被发现，多种耐药机制与生物膜的形成有关，但是具体耐药机制尚不清楚。传统的抗真菌药物已不能满足治疗产生物膜真菌引起的感染，所以，研究生物膜的形成以及它的相关的基因、耐药机制对研发新的抗真菌治疗靶点具有非常重要的意义。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.033

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)10-1382-04

(收稿日期：2015-12-07)

作者简介：疏义林，男，检验师，主要从事微生物分子诊断方向的研究。△通讯作者，E-mail：sjhongpei@163.com。