影响念珠菌混合生物膜形成因素的研究进展

李倩倩 邵菁,3 吴大强,3 汪天明,3 汪长中,3

(1. 安徽中医药大学中西医结合学院，合肥 230012； 2. 安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥 230012； 3. 安徽中医药大学复方安徽省重点实验室，合肥 230012)

念珠菌属(Candidaspp.)是条件致病性真菌，主要存在于皮肤、口腔、胃肠黏膜等部位[1]。常见念珠菌属包括白念珠菌(Candidaalbicans)和非白念株菌(non-albicansCandidaspecies)，后者主要包括光滑念珠菌(Candidaglabrata)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)等[2]。随着广谱抗生素和免疫抑制剂的使用，很多念珠菌属临床分离株具有较强的耐药性，往往造成较高的临床致病率和致死率(30%～40%)[3]。生物膜(biofilm)的形成是念珠菌属耐药性的重要原因之一，目前大部分常见念珠菌属都能形成生物膜[4]，而念珠菌感染往往与两种或两种以上念珠菌形成的混合生物膜(mixed biofilm)有关。比如在严重口腔念珠菌病患者和外阴念珠菌病患者的感染部位能够分离出白念珠菌和光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等非白念株菌[5-6]，42%的HIV阳性患者口腔常出现两种以上念珠菌感染[7]，这可能与念珠菌混合生物膜往往比单一生物膜(single biofilm)具有更强致病力有关[8-9]。本文就影响念珠菌属混合生物膜的形成因素进行综述。

1 种 属

白念珠菌与非白念珠菌以及非白念珠菌之间形成混合生物膜的能力是不同的。Rossoni等研究表明克柔念珠菌和光滑念珠菌能够在体内外形成混合生物膜。在体外培养时，光滑念珠菌在单一生物膜中比其在混合生物膜中具有更高的菌落形成单位(colony formation unite)，而克柔念珠菌则刚好相反；光滑念珠菌单一生物膜的代谢活性显著高于混合生物膜，克柔念珠菌的代谢活力则在单一生物膜和混合生物膜中无差异；感染小鼠口腔后发现，光滑念珠菌单一生物膜的菌落形成单位也明显高于混合生物膜中的光滑念珠菌，说明克柔念珠菌在混合生物膜中抑制了光滑念珠菌的生长，这有利于两者的口腔定植和生物膜形成[10]。Rossoin等[11]还研究了白念珠菌分别与光滑念珠菌和克柔念珠菌之间的相互作用。在体外实验中，混合生物膜中白念珠菌菌落形成单位显著低于单一生物膜(白念珠菌与光滑念珠菌混合时减少了77%，与克柔念珠菌混合时减少了89%)；将单菌和混合菌分别感染幼虫后发现，单菌感染组在18 h内全部死亡，而混合感染组分别在72 h(白念珠菌和光滑念珠菌)和96 h(白念珠菌和克柔念珠菌混合)全部死亡，说明白念珠菌与光滑念珠菌、克柔念珠菌都能形成混合生物膜，且相互之间均为竞争关系；同时白念珠菌单一生物膜比白念珠菌-光滑念珠菌、白念珠菌-克柔念珠菌混合生物膜的毒力更强。白念珠菌也可以与都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)形成混合生物膜，并且在混合生物膜中白念珠菌的生长比都柏林念珠菌更具有优势[12]。

2 基 因

在念珠菌属混合生物膜的形成过程中，念珠菌之间相关基因表达的变化对混合生物膜的形成可造成影响。

2.1 细胞壁蛋白相关基因

Cabral等[13]研究表明PGA基因可不同程度地促进白念珠菌PGA过表达株和正常株单一生物膜和混合生物膜的形成，PGA59和PGA22基因的过表达均可增强白念珠菌黏附非生物底物的能力，PGA22通过改变细胞壁结构和/或功能影响细胞黏附。

2.2 菌丝相关基因

Richard[14]等通过白念珠菌缺陷株的筛选，发现nup85、suv3和mds3突变株不能形成菌丝；当突变株和正常株按照1∶1的接种量混合培养时，这些突变株的菌体细胞可以进入正常株的生物膜中形成混合生物膜，从而弥补它们的黏附缺陷。将光滑念珠菌细胞壁蛋白EPA1和EPA6基因表达作为对照组，当光滑念珠菌和白念珠菌混合培养时，白念珠菌上调了5个编码光滑念珠菌细胞壁蛋白基因的表达(EPA8、EPA19、AWP2、AWP7和CAGL0F00181)，这有利于光滑念珠菌的定植，加大了口腔混合感染的风险[15]。Barros等[16]将白念珠菌分别与光滑念珠菌和克柔念珠菌混合培养后发现，与单独培养的白念珠菌相比，混合培养时光滑念珠菌(P=0.0025)和克柔念珠菌(P=0.0005)能显著抑制白念珠菌丝状化，而且白念珠菌的HWP1基因表达也明显减少。

2.3 生物膜相关基因

Barros等[17]将白念珠菌和克柔念珠菌、光滑念珠菌分别单独或共培养0 h、12 h和24 h形成单一生物膜和混合生物膜，通过qRT-PCR分析发现，当与克柔念珠菌共培养时，白念珠菌的ALS3、HWP1、BCR1、EFG1和TEC1等生物膜相关基因表达被完全抑制，表明这两个菌属之间的转录组和表型之间存在拮抗关系；当与光滑念珠菌共培养时，白念珠菌显示出与克柔念珠菌相似的基因表达谱，但改变程度较小。该研究结果表明，克柔念珠菌和光滑念珠菌可通过改变或抑制白念珠菌黏附和生物膜的形成，与白念珠菌形成竞争关系，进而影响致病性。

3 接种量比与营养成分

不同念珠菌属对碳氮源的需求不太一样，在共培养的过程中会对周围营养产生竞争，营养竞争又会反过来对种群数量产生重要影响，而作为菌体起始浓度的接种量比会进一步加剧种群之间的营养竞争。

3.1 接种量比

Olson等[18]研究了白念珠菌和光滑念珠菌初始接种量比的不同对二者混合生物膜形成的影响，发现白念珠菌和光滑念珠菌接种量比分别为1∶3和1∶1时，与白念珠菌单一生物膜相比，二者混合生物膜的菌团量(biomass)明显增加；培养6 h的混合生物膜厚度比白念珠菌单一生物膜明显增大。我们在前期研究中发现，光滑念珠菌和白念珠菌的初始接种比分别为1∶1、1∶2和2∶1时，大部分情况下单一生物膜菌落形成单位明显高于混合生物膜[19]。

3.2 培养基

分别用SDB和RPMI-1640培养基培养白念珠菌和光滑念珠菌时，发现与单一生物膜相比，二者形成的混合生物膜代谢活性无明显差异，而SDB培养的混合生物膜菌团量明显高于RPMI-1640培养的混合生物膜，且SDB培养基中混合生物膜多以酵母态细胞聚集，RPMI-1640培养基中混合生物膜则多以菌丝态出现[20]。我们在前期研究中发现，使用不同培养基(RPMI-1640、YND和YPD培养基)时，混合生物膜中白念珠菌菌落形成单位几乎全部都明显低于光滑念珠菌，而且混合生物膜的总菌落形成单位也都明显低于单一生物膜[19]。

3.3 碳源

Bezerra等[21]发现与无葡萄糖相比，葡萄糖浓度分别为100和300 mmol/L时，白念珠菌-光滑念珠菌混合生物膜菌落形成单位明显升高，其中当葡萄糖浓度为300 mmol/L时，无论单一生物膜还是混合生物膜与无葡萄糖相比不溶性细胞外多糖(insoluble extracellular polysaccharides，IEPS)的含量都显著增加。总的来说，生物膜形成过程中高浓度葡萄糖有利于念珠菌单一生物膜和混合生物膜的生长。Weerasekera等[22]研究葡萄糖、蔗糖和糖精对白念珠菌和热带念珠菌单一生物膜、混合生物膜的影响，发现与不补加上述三种糖相比，5%葡萄糖下混合生物膜的代谢活性比5%的蔗糖更高，且混合生物膜中酵母态细胞比白念珠菌单一生物膜显著减少。

4 抗真菌药物

常用的抗真菌药物包括唑类药物、棘白霉素类药物和多烯类药物，而不同的念珠菌属对不同的抗真菌药物具有不同的敏感性。

4.1 药物动力学

Vipulanandan等[23]研究了氟康唑、卡泊芬净和两性霉素B对混合生物膜(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌)的影响，结果发现这4种念珠菌形成的混合生物膜经氟康唑处理后，标准菌株和临床菌株(包括敏感株和耐药株)分别形成的混合生物膜中光滑念珠菌的占比都高于其他念珠菌；经卡泊芬净处理后，标准菌株混合生物膜中热带念珠菌占比最高，而临床株(敏感株和耐药株)混合生物膜中光滑念珠菌和热带念珠菌占比较高；经两性霉素B处理后，标准菌株混合生物膜中白念珠菌占比最高，但其在临床菌株(敏感株和耐药株)混合生物膜中占比最少，总体来说抗真菌药物有利于非白念珠菌在多物种形成的混合生物膜中生长。Pesee等[24]发现光滑念珠菌单一生物膜和光滑念珠菌-白念珠菌混合生物膜形成能力均显著低于白念珠菌单一生物膜，且单独使用卡泊芬净后，白念珠菌单一生物膜的SMIC50显著低于混合生物膜，而光滑念珠菌单一生物膜的SMIC50与混合生物膜相比没有明显变化；单独使用氟康唑后，光滑念珠菌单一生物膜的SMIC50与混合生物膜相比明显下降；与单独使用时比，二者联用(均为1/4SMIC50)能更显著地抑制混合生物膜菌团量。

4.2 药物渗透作用

Al-Fattani等[25]研究氟康唑和氟胞嘧啶对白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌单一生物膜以及白念珠菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)形成的混合生物膜的渗透，发现氟康唑比氟胞嘧啶能更快地渗透到全部念珠菌单一生物膜中，而氟康唑和氟胞嘧啶分别通过白念珠菌GDH2346、GDH2023和GRI682(临床株)的生物膜扩散速率相似。不过药物通过光滑念珠菌或克柔念珠菌生物膜的扩散率比近平滑念珠菌或热带念珠菌生物膜的快，但是这两种药物通过白念珠菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)形成的混合生物膜扩散率明显低于其单一生物膜。

4.3 其他药物

Carmello等[26]将白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌单一生物膜以及白念珠菌-光滑念珠菌、白念珠菌-热带念珠菌混合生物膜用哌唑嗪(photodithazine，PDZ)和LED灯(37.5 J/cm2, 660 nm)照射。结果显示，150 mg/L哌唑嗪能使3种念珠菌活力分别降低1.0 log10、1.2 log10、1.5 log10，能使混合生物膜中每个念珠菌活力下降1.0 log10，并可使单一生物膜菌团量减少，但对混合生物膜菌团量没有明显影响，这说明哌唑嗪介导的抗菌光动力疗法在灭活单一生物膜时比混合生物膜更有效。Silva等[27]将100 μg/mL的银纳米颗粒和100 μg/mL制霉菌素分别加入到预先形成的白念珠菌和光滑念珠菌的单一生物膜和混合生物膜中，结果发现与空白组相比，无论银纳米颗粒还是制霉菌素都能显著降低白念珠菌和光滑念珠菌形成的单一生物膜和混合生物膜中菌落形成单位和总菌团量，说明二者能显著抑制白念珠菌和光滑念珠菌形成的单一生物膜和混合生物膜。

5 其他相关影响因素

除了上述所讨论的营养物质、抗真菌药物等因素的影响，相关报道发现还有一些其他因素(如被膜基质等)也会对念珠菌混合生物膜的形成产生较大影响。

5.1 生物膜基质(biofilm matrix，BM)

念珠菌属生物膜胞外基质(extracellular matrix)包括蛋白质、脂质、多糖、核酸等[28]。β-1,3-葡聚糖是念珠菌生物膜基质中的一种重要多糖，它有助于生物膜的形成和积累，并保护生物膜中的菌体细胞免受宿主免疫系统和抗菌药物的清除[29]。Tan等[30]发现，β-1,3-葡聚糖酶对浮游状态非白念珠菌的生长和黏附没有影响，但是能抑制热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌共同形成的混合生物膜；两性霉素B和β-1,3-葡聚糖酶联用时，热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌单一生物膜以及三者形成的混合生物膜菌体细胞新陈代谢活力显著降低，β-1,3-葡聚糖酶可以恢复混合生物膜菌体细胞对抗真菌药物的敏感性。

5.2 群感效应分子(酪醇、法尼醇)

Monteiro等[31]用40 mmol/L酪醇和60 mmol/L法尼醇联合处理白念珠菌和光滑念珠菌的单一生物膜和混合生物膜，与未处理组相比，白念珠菌单一生物膜和混合生物膜的菌团量都增加，但光滑念珠菌单一生物膜菌团量减少，同时白念珠菌和光滑念珠菌的单一生物膜和混合生物膜代谢活性都显著降低，混合生物膜中光滑念珠菌菌落形成单位减少比白念珠菌减少的更多，且混合生物膜中菌丝和酵母态细胞明显减少。Arias等[32]使用白念珠菌ATCC10231和光滑念珠菌ATCC90030在丙烯酸树脂和羟基磷灰石表面形成单一生物膜和混合生物膜，结果发现200 mmol/L酪醇能显著降低在两个表面上形成的单一生物膜和混合生物膜代谢活性及菌落形成单位，并能造成菌体细胞损伤，说明酪醇对二者形成的混合生物膜具有抑制作用。

5.3 益生菌

研究表明乳酸杆菌属具有抗真菌及其生物膜的作用[33]。Tan等[34]研究发现乳酸杆菌上清液可抑制热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌单一生物膜以及三者形成的混合生物膜生长和细胞活力，而且在预先形成的生物膜中添加乳酸杆菌上清液也能破坏生物膜的进一步形成。Kunyeit等[35]研究发现酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和伊撒酵母菌(Issatchenkiaoccidentalis)对光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌分别与白念珠菌形成的混合生物膜有明显的抑制作用。

6 小 结

一般来说，相比单一生物膜，念珠菌混合生物膜的毒力更强，对抗真菌药物的敏感性更低。目前虽然发现种属及其他相关因素(如营养物质、抗真菌药物等)会对念珠菌混合生物膜的形成产生影响，但是具体到特定念珠菌属混合生长的作用机制研究则仍属于起步阶段，某些菌属混合生长的报道还有不一致的地方。念珠菌之间的相互作用是病原性真菌研究的重要课题，将有助于对真菌混合生物膜耐药机制的深入认识，对临床真菌治疗也具有极为重要的指导意义。