上皮间质转化相关信号通路在肝纤维化中作用的研究进展

熊盼盼　刘　菲



上皮间质转化相关信号通路在肝纤维化中作用的研究进展

熊盼盼刘菲

201203同济大学附属东方医院胃肠内科

摘要：肝脏细胞上皮间质转化(EMT)是指在慢性肝损伤的微环境下上皮细胞失去原有特性而获得成纤维细胞典型特征的病理过程。EMT最终将导致肝纤维化。多种信号因子和多条信号通路参与EMT过程，研究表明，这些通路之间并不是独立存在的，相互之间存在紧密联系。近年来，靶向治疗已经成为肝纤维化治疗的研究热点之一，信号通路的研究为肝纤维化的靶向治疗提供了重要依据。

关键词：上皮间质转化；肝纤维化；信号通路

肝纤维化是指在慢性肝脏损伤和炎性反应刺激的作用下，细胞外基质(ECM)增生和降解失衡，从而引起肝脏内纤维结缔组织的异常沉积，肝小叶重构，假小叶及结节形成，并最终导致肝硬化。ECM的产生主要来源于3条途径：(1)肝脏自身产ECM细胞，包括肝星状细胞(HSC)和门管区成纤维细胞；(2)骨髓源性的间充质细胞；(3)发生肝上皮间质转化(EMT)的肝细胞和胆管细胞[1]。以前普遍认为活化的HSC是ECM的主要来源，肝细胞则是纤维化过程中的受害者，目前则认为肝细胞也参与其中。Nitta等[2]研究发现，约1/3纤维细胞由肝脏细胞EMT过程产生。近年来研究表明，肝EMT可通过独特的信号通路加速肝纤维化，是有效的肝纤维化治疗靶标，阻断EMT过程，可抑制肝纤维化的发生发展。

1EMT

1.1EMT的定义

EMT是一个转分化过程，在小鼠单侧输尿管梗阻模型中首次被证实，它是指上皮细胞失去顶-基底极性和黏附性，并向间质成纤维细胞转变。在肝细胞中主要表现为：上皮细胞失去其多边紧密连接形态，并转变为排列松散的、梭形间质细胞；肝细胞表面的E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白 1 (ZO-1)等上皮表型标志物的丢失以及波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)等间质表型标志物的获得；肝细胞基底膜降解，并可以自由移行产生胶原。实际上，在肺脏、肝脏、肾脏等器官的纤维化和癌变过程中，EMT都参与其中并发挥了重要的作用。

1.2EMT的分型

EMT可分为3型：1型EMT与受精卵着床、胚胎形成和器官的发育有关，在胚胎发育期参与原肠胚、神经嵴等的形成；2型EMT与器官纤维化、损伤修复及组织再生相关，例如在创伤和炎性损伤等持续刺激下，上皮细胞可被诱导转变为纤维原细胞，从而促进器官发生纤维化；3型EMT则与肿瘤的侵袭和转移密切相关，例如在早期癌巢中，上皮细胞转变为转移肿瘤细胞，从而通过血液发生转移[3]。研究表明，肝纤维化的发生发展主要与2型EMT有关。本文将主要阐述2型EMT参与肝纤维化的作用机制。

1.3EMT的特征

EMT较显著的特征是细胞表型的改变。研究表明，在EMT时，免疫荧光显示上皮表型标志物(如E-cadherin、ZO-1和白蛋白等)的表达发生下调；而其间质表型标志物[如vimentin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、N-cadherin等]的表达则上调[4]。实际上，在EMT发生的同时，成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1，亦称S100A4)也会表达上调，但是其只表达于炎性巨噬细胞中，而不表达于产ECM的细胞，所以不属于纤维母细胞的特征标志物[5-7]。

EMT的另一种特征是损伤的组织细胞获得移行性表型。损伤的组织细胞释放一些细胞因子如转化生长因子β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)等，这些细胞因子激活包括TGF-β1/smad信号通路、Hedgehog(Hh)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路等在内的多条信号通路。信号通路之间可以相互调节和促进，这些信号通路可作用于下游的转录辅助阻遏因子(如锌指转录因子Snail超家族、Twist等)和转录辅助活化因子，从而调控靶基因的转录，导致E-cadherin等上皮表型蛋白表达下调，vimentin等间质表型蛋白表达上调，最终导致上皮细胞表达间质细胞表型，移行并产生ECM沉积，从而促进肝脏的纤维化。

2EMT相关信号通路在肝纤维化中的作用机制

多条信号通路参与调节EMT，进而影响肝纤维化的发生发展。例如由胆源性病因引起的肝纤维化，其信号通路主要为Hh信号通路；肝细胞性病因所致的肝纤维化，其主要为TGF-β1信号通路；Notch信号通路、表皮生长因子受体(EGFR)信号通路等也参与了肝纤维化。同时，信号通路之间也存在着密切联系。

2.1Hh信号通路对EMT的调控

Hh信号通路包括Hh膜受体[Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)]、转录因子Ci/Gli、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Fused(Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、类运动蛋白costal-2(cos2)和蛋白激酶A(PKA)等组成成分。

在肝纤维化过程中，Hh信号通路在抑制HSC凋亡和增殖方面起着重要作用，同时也参与了EMT过程，在胆管细胞中表现得尤为明显，比如胆管闭锁(BA)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等胆汁淤积性疾病发生肝纤维化时，肝胆管上皮细胞发生EMT，转变成间质细胞，并参与纤维化的形成。

Xue等[8]和Omenetti等[9]发现，BA时，肝胆管上皮细胞中Hh配体表达上调，Hh靶基因表达增加，同时Hh转录因子Gli2和vimentin共定位于肝小叶间导管上皮。Jung等[10]发现，PBC时，肝胆管细胞中同时表达细胞角蛋白19(CK19)、Gli2和Ptc。Syn等[11]在研究食物诱导下发生的NAFLD时发现，未成熟的胆管祖细胞发生EMT并转变成间质纤维细胞，并离开原来位置移行至肝实质细胞中替代坏死的肝细胞，从而促进肝纤维化的发生发展。同时有研究证实，在胆道结扎术(BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型中，胆管细胞可发生EMT，胆管细胞表型标志物由E-cadherin、ZO-1转变为vimentin、α-SMA、Ⅰ型胶原，而肝细胞中没有出现类似的改变，提示仅肝胆管细胞发生EMT[1]。

胆汁淤积性肝纤维化过程中，Hh信号通路被激活，Hh蛋白释放，与Ptc受体结合，解除了Ptc受体对Smo受体的抑制作用，从而活化了Gli家族和PKA，激活cos2、SuFu和Fu并形成复合物，使Gli蛋白进入核内并激活下游靶基因如Twist、Snail等转录辅助阻遏因子、细胞周期蛋白D1等转录因子和转录辅助活化因子，在这些转录因子的共同相互作用下，E-cadherin等上皮表型标志物表达下降，而N-cadherin等间质表型标志物的表达则上升。胆管细胞表型的改变随即导致细胞的移行，发生ECM，从而促进纤维化。

2.2TGF-β1信号通路对EMT的调控

在病毒性肝炎等肝病的肝损伤中，库普弗细胞、肝细胞、HSC、自然杀伤(NK)细胞、淋巴细胞和树突状细胞均会分泌炎性细胞因子，包括TGF-β1、肿瘤坏死因子(TNF)等，其中TGF-β1是目前公认最强的促纤维分泌因子，TGF-β1在EMT中发挥了重要作用，其主要通过参与TGF-β1/smad信号通路和non-smad信号通路来调控这一过程。在一项CCl4诱导小鼠肝纤维化的模型中，证实了TGF-β1信号通路参与了肝纤维化的主要通路[7,12]。

在TGF-β1/smad信号通路中，TGF-β1 Ⅱ型受体活化并磷酸化Ⅰ型受体，两者形成复合物后，依次活化并磷酸化smad2/3和smad4，后者发生核转位并与Snail和Twist等转录因子相互作用，从而调控肝细胞表型蛋白的表达。

在non-smad信号通路中，通过TGF-β1受体的磷酸化或直接作用，激活下游通路的活化激酶，后者再分别激活下游的一系列信号通路，如PI3K、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p38MAPK激酶等信号通路，最后作用于下游的转录辅助阻遏因子和转录辅助活化因子，在这些转录因子的相互作用下调控靶基因的转录，从而下调上皮表型标志物，上调间质表型标志物，导致肝细胞EMT。

Nitta等[2]研究发现，通过对肝硬化后的肝细胞转染smad7，可以抑制smad2和smad3的表达，从而抑制了smad信号通路，同时也抑制了p-Akt的表达；同样使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002也可以抑制smad信号通路，表明smad信号通路与non-smad信号通路下游的PI3K/Akt信号通路之间存在着相互交叉联系。上述研究表明，受损的肝细胞经TGF-β1作用后，可激活下游的多条信号通路，在各信号通路的相互作用下，肝细胞表型发生改变，导致EMT，同时引起细胞移行并产生胶原，从而促进肝纤维化的形成。

2.3信号通路间的相互作用

肝细胞EMT发生时，细胞上皮表型标志物中主要的改变是E-cadherin的下调，其下调主要由4种转录阻遏因子调控[13]：转录因子Snail超家族(由Snail1和Snail2组成)、bHLH因子、Twist和Zeb家族(由Zeb1和Zeb2组成)。实际上，各转录因子间也存在相互促进和协调的作用。Snail1可大幅抑制E-cadherin的mRNA和蛋白质水平的表达；Snail1还可以参与调控Zeb1的转录，当Snail1被敲除时，Zeb1的表达也相应减少；而Snail1和Twist则协同调控相关靶基因的转录，当Twist被敲除时，Snail1的上调就相对滞后[14-15]。

TGF-β1信号通路和Hh信号通路可共同调控Twist和Snail等转录因子，并且这两条信号通路起着相互协调和促进的作用。smad活化的转录因子Snail和Twist的表达可被Hh激活的Gli蛋白增强，同时，TGF-β1在没有活化的smo受体的前提下可以直接促使Gli蛋白表达，从而调节下游靶基因的表达，用环巴明抑制Hh信号通路后，TGF-β1的表达水平下降[16]。

Notch信号通路也参与了肝细胞EMT过程[17-18]，而且其与TGF-β1也存在相互促进的作用机制。Notch作为跨膜蛋白受体，与配体结合被激活后，其胞内活化域(NICD)发生核转位并作用于Snail的启动子上，促进Snail的表达。此外，TGF-β1可以促进Notch1、Notch4受体和Jagged1、Jagged2配体的表达，NICD可与smad3结合形成复合体，后者可促进胞内TGF-β1的活性，从而激活smad3基因的启动子。

Kang等[19]研究表明，在肝纤维化和肝细胞癌中TGF-β1信号通路和EGFR信号通路相互补充促进四次跨膜蛋白TM4SF5的表达，从而促进肝细胞EMT的发生。TGF-β1体外培养的肝细胞加入EGFR抑制剂可以阻断TM4SF5的表达和EMT的发生，smad的高表达可以促进EGFR和TM4SF5的表达，提示smad和EGFR信号通路对于TM4SF5的表达存在着相互作用，从而促进肝细胞EMT的发生。

综上所述，参与肝细胞EMT的多条信号通路之间存在着相互作用，共同调节肝细胞EMT。

3总结及展望

Hh信号通路和TGF-β1信号通路等共同参与了调节肝细胞EMT，进而影响肝纤维化的发生发展，信号通路之间存在着紧密联系，联合治疗是肝纤维化治疗的较好选择。

通过骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、肝细胞生长因子(HGF)等内源性抑制分子可阻断肝细胞EMT的信号通路。Bi等[20]的研究发现，在EMT过程中，TGF-β1∶BMP-7 = 1∶10是较好的平衡比例，当这个比例增加时，E-cadherin的表达就会逐步下调，更倾向于发生肝细胞EMT。亦可通过外源性抑制药物如TGF-β1信号通路抑制剂(蜂毒明肽、塞来昔布、阿仑膦酸钠等)[21-25]和Hh信号通路抑制剂[环巴明、单克隆抗体5E1、GDC-0499等][24-25]阻断相关信号通路，抑制EMT的发生，但要注意药物对机体的不良反应。研究表明，外源性抑制药物也可以通过诱导产生内源性信号分子参与信号通路的阻断。Bi等[23]研究发现，阿仑膦酸钠可以在抑制TGF-β1诱导的肝细胞EMT的同时，促进BMP-7的表达，参与BMP-7介导的间质上皮转化(MET)，逆转肝纤维化；此外，也可通过miRNA(结合于mRNA UTR，起到抑制翻译起始或降解mRNA的作用)转染来抑制肝细胞EMT[26]。Zhang等[13]研究表明，miR-30可通过作用于转录因子Snail1来调控肝细胞EMT的发生，从而抑制了上皮表型向间质表型的转变。

肝细胞EMT信号通路的研究为肝纤维化靶点治疗开辟了新的道路，但EMT受多种细胞因子和多条信号通路的调控，各种信号通路和细胞因子之间的相互协同作用尚不清楚，有待于进一步探究，恰当的治疗时间点的选择、联合治疗方案中的药物搭配和抑制剂剂量的控制等也有待进一步深入研究，从而为肝纤维化的治疗提供更合理、精准、有效的方案。

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(本文编辑：周骏)

通信作者：刘菲，Email: 13301921052@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.007

(收稿日期：2015-11-03)