吲哚胺2，3-双加氧酶及细胞因子在创伤后应激障碍患者中的表达变化及意义*

殷　莉，　黄姗姗，　何主强

华中科技大学同济医学院附属同济医院1妇产科2神经内科，武汉　430030

3武汉市第一医院神经外科，武汉　430022



吲哚胺2，3-双加氧酶及细胞因子在创伤后应激障碍患者中的表达变化及意义*

殷莉1，黄姗姗2，何主强3△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1妇产科2神经内科，武汉430030

3武汉市第一医院神经外科，武汉430022

摘要：目的探讨干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)与吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxy-genase，IDO)在创伤后应激障碍(PTSD)患者血清中表达变化及其临床意义。方法采集80例PTSD患者血清，同时收集80例健康对照组血清，运用酶联免疫吸附法(ELISA)和Western blot的方法对PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO进行检测，与对照组进行比较。结果实验表明PTSD组及正常对照组血清INF-γ、TNF-α、IL-6、IDO水平分别为[(28.43±11.23)vs.(3.01±1.12)pg/mL]、[(14.58±2.16)vs.(2.45±0.90)pg/mL]、[(16.34±5.31)vs.(2.01±1.08)pg/mL]、[(0.223 5±0.061 1)vs.(0.031 2±0.001 6)]，PTSD组明显高于正常对照组(均P<0.01)。结论INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO表达的异常升高可能在PTSD的发病机制中扮演重要角色。

关键词：创伤后应激障碍；吲哚胺2，3-双加氧酶；细胞因子

创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder，PTSD)是指一种由重大自然灾害、恐怖事件、战争、意外交通事故、罹患癌症、刑事犯罪、精神虐待等严重刺激因素引发的精神异常反应[1-2]。随着社会压力的增加，PTSD患者发病率逐渐升高，且具有发病时间长、临床疗效差等特点，其病因目前尚不明确，现已从早期的神经递质紊乱学说转变为对神经心理-内分泌-免疫系统失衡的研究。其中细胞因子对机体免疫系统应答发挥重要的调节作用，且作为一种神经介质在中枢神经系统表达，调控机体神经生化、神经内分泌与行为的改变[3-4]。细胞因子(cytokine，CK)分为两类，一类为前炎性因子(如INF-γ、TNF-α、IL-6)，其作用是刺激免疫细胞，对受损的细胞发挥局部及远程效应[5]，另一类为抗炎性因子(如IL-4、IL-10、IL-13)。IDO作为色氨酸-犬尿氨酸代谢路径上的首个限速酶，主要表达于外周巨噬细胞与中枢星形胶质细胞及小胶质细胞，同时前炎性细胞因子可刺激IDO分泌增多。IDO的异常表达存在于多种急慢性神经退行性疾病中[6]。本实验检测PTSD患者血清中CK：INF-γ、TNF-α、IL-6水平及IDO含量变化，初步探索前炎性细胞因子中INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO与PTSD发病的关联，为进一步研究PTSD发病机制提供新的思路。

1对象与方法

1.1研究对象

PTSD组：为2013年2月至2014年6月在同济医院神经内科就诊的PTSD患者。入选标准：由神经内科的精神专业医生参照第4版的美国PTSD诊断标准(DSM-Ⅳ)确诊为PTSD，患者既往无神经系统疾病和焦虑症、抑郁症等精神障碍与内分泌系统和传染病史。对照组：为2013年2月至2014年6月选取同期在同济医院行健康体检人群。入组标准：①与PTSD组按照年龄、性别配对；②无心、肝、胰、肺、肾等脏器疾病；③无精神病及传染病史；④近3月内未服用甾体或非甾体类抗炎药。本研究取得医院医学伦理委员会批准，受检者均签署知情同意书。

最终共选取80例PTSD患者，病程0.5~1 7年，平均病程(8.96±5.92)年，其中男性46例，女性34例，年龄26~58岁，平均年龄为(41±11)岁。对照组按性别、年龄1：1配对选取80例，男性46例，女性34例；年龄25~60岁，平均年龄(41±14)岁。

1.2实验方法

1.2.1样本收集于7：00~8：00 Am空腹静脉采血8 mL，离心后分离血清，保存在-80℃低温冰箱。检测血清中INF-γ、TNF-α、IL-6与IDO表达情况。

1.2.2检测方法①采用Western blot检测血清中IDO表达：标本于冰上加入三去污裂解液200 μL，蛋白裂解30 min后进行总蛋白的提取，采取Bradford法测定蛋白的浓度。将组织提取的蛋白浓缩液经95℃变性后进行SDS-PAGE电泳、染色、转膜，加入羊抗人IDO多克隆抗体(1：500)、人抗鼠β-actin抗体(1：500)，然后在4℃条件下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记鼠抗羊抗体/鼠抗人抗体(1：200)，在室温条件下孵育1 h。采用增强化学发光显色液进行显色，最后进行胶片的曝光、洗片。以GDS-8000型全自动凝胶成像分析系统(英国UVP公司)对蛋白条带进行扫描并最终定量分析实验结果，结果为IDO /β-actin灰度值。②采用夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中INF-γ、TNF-α、IL-6含量：收集的标本按试剂盒(武汉德邦生物科技有限公司)说明书程序进行测定。

1.3统计学处理

2结果

PTSD组和对照组血清细胞因子及IDO水平检测，结果显示，PTSD组的血清INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO含量变化均显著高于对照组(均P<0.01)，结果见表1，图1。

表1　两组细胞因子及IDO含量比较

与对照组比较，*P<0.01

图1　Western blot检测IDO含量Fig.1 Western blot analysis of the level of IDO

3讨论

机体的应激反应、情绪调控、觉醒的维持主要由下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴、交感与副交感神经及5-羟色胺(5-HT)调节系统控制[7]。强烈的机体应激导致细胞因子分泌异常增加，应激源刺激机体下丘脑-垂体-肾上腺轴兴奋性升高。一般状态下，适度的皮质醇分泌能减轻炎性细胞因子对机体过度损伤。而PTSD患者后期由于HPA轴功能紊乱，使皮质醇功能低下导致缺乏足够的应激适应，造成不可逆的细胞及功能损伤[8]。检测结果表明PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6表达增加，而早期的研究表明细胞因子中的INF-γ、TNF-α、IL-6可由主动转运通过跨膜蛋白进入脑组织，作为启动颅内炎症反应的重要致炎性细胞因子，INF-γ、TNF-α、IL-6可能在PTSD发病机制中扮演了重要角色。有研究表明[9-10]，抑郁症患者血清中IL-6含量与临床表现呈正相关，现已把IL-6检测作为抑郁症的重要指标。本实验中PTSD患者的INF-γ、TNF-α、IL-6表达增高，推测PTSD发病与炎性应答免疫系统的激活有关，是一种心理神经免疫紊乱性疾病。外周的免疫系统通过激活并释放前炎性细胞因子，导致脑部继发性损伤及与PTSD相关的神经内分泌、神经生化和行为改变[11-12]。

IDO在外周组织的炎性应答中可被多种细胞因子激活。本实验检测结果表明PTSD患者血清中INF-γ、TNF-α、IL-6升高的同时伴有IDO表达增加。研究发现IDO在抑郁患者的大脑前额叶、海马及纹状体等区域表达异常，PTSD的脑部病理改变也主要涉及这些脑区[13-14]，推测IDO可能与PTSD的发病机制密切相关。研究表明[15-18]IDO在脑组织内表达与炎性活动有关，与本研究结果相一致。提示IDO是许多急性和慢性神经退行性病变的重要致病因素。IDO表达增加导致PTSD患者中枢神经系统中5-HT能神经递质功能下降及炎性因子进一步释放。IDO和其后继酶-犬尿酸单加氧酶在细胞因子作用下活性增强，从而使喹啉酸合成激动剂：喹啉酸-谷氨酸能N-甲基天冬氨酸受体表达增多，喹啉酸在多种急慢性神经变性性疾病中为重要的神经毒性物质。应激的组织及细胞中，由于细胞因子分泌增多，引发机体产生后续的损伤。本研究结果显示，与对照组相比，PTSD患者血清INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO水平升高，提示细胞因子、IDO系统及炎症反应在PTSD的发病过程中可能扮演了重要的角色。另外，还有研究证明[17]，PTSD大鼠海马内INF-γ、TNF-α、IL-6及IDO增加，早期给予选择性IDO抑制剂(新型恶二唑基-N-羟基苯甲脒)可改变海马内增加的前炎性因子水平及五羟色胺水平。因此IDO抑制剂可能是PTSD新的治疗手段。

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(2015-07-26收稿)

Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase and Cytokines in Patients with Post-traumatic Stress Disorder

Yin Li1，Huang Shanshan2，He Zhuqiang3△

1DepartmentofObstetricsandGynecology，2DepartmentofNeurology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China，3DepartmentofNeurosurgery，WuhanFirstHospital，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo investigate the expression levels of interferon-γ(INF-γ)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-6(IL-6)and indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)in the serum of patients with post-traumatic stress disorder(PTSD)and the clinical significance.MethodsSerum samples were collected from 80 PTSD patients and 80 healthy individuals.The serum concentrations of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Western blot in both groups.ResultsThe concentrations of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO were(28.43±11.23)pg/mL，(14.58±2.16)pg/mL，(16.34±5.31)pg/mL and (0.223 5±0.061 1)，respectively，in PTSD group，significantly higher than those[(3.01±1.12)pg/mL，(2.45±0.90)pg/mL，(2.01±1.08)pg/mL and(0.031 2±0.001 6)]in control group(P<0.01).ConclusionOverexpression of INF-γ，TNF-α，IL-6 and IDO may play an important role in the pathogenesis of PTSD.

Key wordspost-traumatic stress disorder；indoleamine 2，3-dioxygenase；cytokine

中图分类号：R329.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.024

通讯作者△，Corresponding author，E-mail：colei@sina.com

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2015CFB694)

殷莉，女，1978年生，主治医师，医学博士，E-mail：yinli@mails.tjmu.edu.cn