群居相互接触对小鼠脑梗死康复训练效果及预后的影响

邹　潇，　聂淑科，　谭　旸，　张允建△

1武汉大学医院本部内科，武汉　430072

2华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉　430022



群居相互接触对小鼠脑梗死康复训练效果及预后的影响

邹潇1，聂淑科2，谭旸2，张允建2△

1武汉大学医院本部内科，武汉430072

2华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉430022

摘要：目的探讨群居相互接触对脑梗死小鼠康复训练效果的影响及可能机制。方法2月龄雄性C57BL/6小鼠96只，随机分为4组，假手术隔离饲养组16只，假手术配对饲养组16只，大脑中动脉缺血(MCAO)隔离饲养组32只，MCAO配对饲养组32只。假手术组小鼠行假手术，模型组小鼠行MCAO手术，术后根据分组分别行单只隔离和配对饲养。各组小鼠均于术后进行康复训练：每天进行1 h转棒、平衡木及网屏训练。康复训练后第1、3、7、14天行动物行为学评分，测量血清C-反应蛋白(CRP)浓度；第14天处死小鼠，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测脑梗死体积。结果在康复训练第7及14天，MCAO配对饲养组小鼠的行为学评分和血清CRP水平均低于MCAO隔离饲养组小鼠(均P<0.05)，且假手术配对饲养组血清CRP水平低于假手术隔离饲养组；第14天时，MCAO配对饲养组和MCAO隔离饲养组小鼠脑梗死体积差异无统计学意义(P>0.05)。结论群居相互接触有助于增加康复训练效果，降低血清CRP水平，对脑梗死体积无影响。

关键词：群居相互接触；脑梗死；康复训练；C-反应蛋白

对缺血性脑血管病患者在发病早期进行及时有效的康复训练，可以促进脑梗死后患者神经功能恢复，明显减少继发性残疾，提高生活质量[1]。卒中后，与外界沟通和接触较多患者的预后往往好于那些与社会脱离的孤独患者[2-3]。卒中后患者往往伴有不同程度的抑郁情绪，与周围环境交流减少，对卒中的预后产生负面影响[4]。C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)在正常人体血清中含量少，但在严重感染、损伤和坏死等情况下其水平可显著升高，有研究发现CRP与脑梗死关系密切[5]。近来研究表明，焦虑抑制状态与社会活动、免疫因素(如CRP)有着密切的关系[6]。本研究着重观察群居接触(social interaction)对脑缺血小鼠模型康复效果及预后的作用，同时观察其对血清CRP水平的影响。

1材料和方法

1.1试剂与仪器

小鼠超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)ELISA试剂盒购自中美科技有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)购自美国Sigma公司，其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2实验动物及分组

2月龄C57BL/6雄性小鼠96只，体质量约20 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。将实验小鼠随机分为4组，假手术隔离饲养组16只，假手术配对饲养组16只，大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)隔离饲养组32只，MCAO配对饲养组32只。各组小鼠行MCAO手术或假手术，术后动物分为单只隔离饲养和配对饲养。配对饲养为2只雄性小鼠一笼。

1.3MCAO模型的制备

MCAO模型制备参照Hata等[7]的方法改良，缺血1 h后将线栓取出。假手术组采用同样的手术操作但不插入线栓。

1.4术后康复训练及指标检测

所有小鼠均于术后即开始进行康复训练。分别进行平衡木行走、转棒转动训练及网屏抓握训练，每项20 min，共1 h。于康复训练后1、3、7、14 d，MCAO各组分别取8只小鼠，假手术组分别取4只小鼠，进行行为学评分。行为学测试完毕，处死小鼠，留取全血，4 000 r/min离心5 min，取上清-80℃保存，测CRP浓度。

1.5康复训练方法

①平衡木训练，让鼠在1个方木棒上行走，主要评估及训练平衡功能。②转棒训练，是将鼠放在1根分别向顺、逆时针交替转动的木棒上行走，评估及训练动态平衡功能。③网屏训练，是先将网屏水平放置，将鼠放在其上，然后缓缓地将其一端抬高，在2 s内将此屏变成垂直位，保持5 s，观察鼠是否会从网屏上掉下来或用前爪握住网屏，用于评价前爪抓握能力及肌力情况。

1.6行为学评分

①平衡木行走评分：能跳上横木，在上面行走不会跌倒为0分；能跳上横木，在上面行走跌倒的机会小于50%为1分；能跳上横木，在上面行走跌倒的机会大于50%为2分；在健侧后肢帮助下能跳上横木，但受累的瘫侧后肢不能帮助向前移动为3分；在平衡木上不能行走，但可坐在上面为4分；将鼠放在平衡木上会掉下来为5分。

②转棒行走评分：棒转动过程中鼠可在转棒上行走为0分；转动过程中鼠不会掉下且持续时间达60 s以上为1分；转动开始后，鼠从棒上掉下来为2分；转动开始前鼠就从棒上掉下来为3分。

③网屏试验评分：鼠前爪抓住网屏达5 s，且不滑落为0分；鼠暂时握住网屏，滑落一段距离，但未掉下来为1分；鼠在5 s内掉下来为2分；网屏转动开始时鼠即掉下来为3分。

取每组每只小鼠各项评分之和的平均值，作为其综合评分。

1.7血清CRP浓度

ELISA法检测，具体方法按说明书进行。

1.8脑梗死体积测定

术后第14天，处死动物，快速取小鼠全脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，行冠状大脑切片，每片厚1 mm，迅速置1% TTC中，避光，37 ℃温孵20 min，其间每隔7～8 min翻动1次，染色后以4%多聚甲醛固定。拍照后使用Image Pro Plus软件分析计算脑梗死体积。

1.9数据分析及统计学处理

2结果

2.1各组小鼠术后不同时间点行为学评分比较

随着时间推移，各组小鼠行为学评分呈下降趋势。MCAO配对饲养组于术后康复7 d、14 d行为学评分明显低于MCAO隔离饲养组，差异具有统计学意义(均P<0.05)(表1)。

2.2各组不同时间点血清CRP浓度比较

MCAO组小鼠在脑缺血康复后1 d，血清CRP浓度即开始增高，明显高于假手术组。缺血康复后3 d，CRP浓度进一步增高，7 d时达高峰，14 d时逐渐降低。MCAO配对饲养组于术后康复7 d、14 d血清CRP浓度明显低于MCAO隔离饲养组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。假手术配对饲养组小鼠随时间推移，血清CRP浓度无明显变化；假手术隔离饲养组小鼠随时间推移，血清CRP浓度逐渐升高，14 d时达高峰，7、14 d时明显高于假手术配对饲养组小鼠，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表1　各组小鼠术后不同时间点行为学评分比较±s)

与MCAO隔离饲养组比较，*P<0.05；与假手术隔离饲养组比较，#P<0.05

表2　各组在不同时间点血清CRP浓度比较

与MCAO隔离饲养组比较，*P<0.05；与假手术隔离饲养组比较，#P<0.05

2.3TTC染色测定脑梗死体积

正常脑组织经TTC染色呈红色，梗死组织呈白色。缺血康复后14 d，假手术隔离饲养组和假手术配对饲养组小鼠脑组织经TTC染色后均未见有白色梗死灶，见图1A、B；MCAO隔离饲养组和配对饲养组缺血小鼠均可见右侧脑组织白色梗死区域；其中隔离饲养组的脑梗死相对体积比为(18.36±3.65)%，配对饲养组为(15.00±4.46)%，两组小鼠脑梗死相对体积比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1C、D。

A：假手术隔离饲养组；B：假手术配对饲养组；C：MCAO隔离饲养组；D：MCAO配对饲养组图1　各组小鼠脑组织TTC染色结果Fig.1 TTC staining of brain tissues of mice in each group

3讨论

卒中后早期康复训练是促进神经功能恢复，改善患者预后的重要手段[8]。康复训练的效果受很多因素影响，患者与周围环境事物的沟通及社会化程度，与康复训练效果关系密切。与社会脱离，孤独，抑郁情绪往往会严重影响康复训练效果及卒中预后[9]。2种饲养方式(单只隔离饲养或者配对饲养)的小鼠均于脑缺血术后即开始系统康复训练，于第1、3、7、14天，通过行为学评分来判断康复训练效果。系统康复训练，可明显降低小鼠行为学评分；配对饲养组小鼠康复效果明显好于单只隔离饲养组小鼠，在术后康复7 d，14 d行为学评分明显低于单只隔离饲养组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。结果提示，增加与环境和外界的沟通，可明显改善康复效果。

两组小鼠在缺血前饲养状态相同，缺血后才分别给予不同的饲养方式。因此，群居相互接触(Social interaction)可能更多的在缺血病灶的二次扩散阶段发挥作用。术后14 d检测脑梗死体积，配对饲养组小鼠脑梗死体积略小于单只隔离饲养组，但两组间差异没有统计学意义。群居相互接触对脑梗死体积的影响及机制需要进一步的实验研究。

C-反应蛋白是一种机体组织损伤或炎症的时相蛋白，其水平在一定程度上反映与缺血性脑卒中病理相关的炎性反应程度，较强的炎性反应可以加速梗死区半暗带的恶化，加重脑损伤，CRP水平和脑梗死的严重程度有一定相关[10]。近来研究还发现，抑郁症患者血清中CRP含量增高，提示CRP与抑郁症存在联系[11]。小鼠脑缺血后，CRP水平在急性期内升高明显，术后7 d达顶峰，14 d逐渐下降。配对饲养可明显降低缺血后小鼠血清中CRP含量，且术后7 d和14 d时与单只隔离饲养小鼠差异明显(P<0.05)。在假手术组，可见随着隔离饲养时间的增加，小鼠血清中CRP水平逐渐增高，14 d时与配对饲养组差异明显(P<0.05)。在健康人群中，同样观察到，减少社会交流会导致血清CRP含量增高[12]。目前研究结果提示，群居相互接触减少，会引起血清CRP含量增高，而增高的CRP会加重缺血后神经功能损伤[13]。

综上所述，群居相互接触可有效增加脑缺血康复训练效果，对神经功能损伤有一定减轻作用，CRP可能在其中扮演了重要的角色，其具体机制还有待进一步研究。

参考文献

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(2015-10-24收稿)

Effects of Social Interaction on Rehabilitation Training Outcomes and Prognosis of Mice with Ischemic Infarction

Zou Xiao1，Nie Shuke2，Tan Yang2etal

1DepartmentofInternalMedicine，HospitalofWuhanUniversity，Wuhan430072，China2DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo explore the effects of social interaction on rehabilitation training outcomes of mice with ischemic infarction and the possible mechanism.MethodsNinety-six male C57BL/6 mice of two months old were randomly divided into four groups：sham operation group with isolated breeding(n=16)，sham operation group with paired breeding(n=16)，middle cerebral artery occlusion(MCAO)group with isolated breeding(n=32)，MCAO with paired breeding(n=32).After the operation，the mice were isolated in individual cages or paired with an animal in different groups.All the mice were given 1-h balancing，grasping，rotating and walking exercises every day.Behavioral assessments were made and the C-reactive protein(CRP)concentrations in blood serum were detected at 1，3，7，and 14 days after rehabilitation training.At 14 days，the animals were sacrificed and the infarct size determined by TTC staining.ResultsThe behavior score and serum CRP level were much lower in MCAO group with paired breeding than in MCAO group with isolated breeding at 7 and 14 days after rehabilitation training(bothP<0.05).The CRP level was also significantly decreased in sham operation group with paired breeding than that in sham operation group with isolated breeding(P<0.05).There was no significant difference in the infarct size of mice between the paired mice with MCAO and isolated MCAO mice at 14days(P>0.05).ConclusionSocial interaction significantly improves the outcomes of rehabilitation training and reduces the serum CRP concentration in mice with ischemic infarction，but has no significant effects on the infarct size.

Key wordssocial interaction；cerebral ischemia；rehabilitation；C-reactive protein

中图分类号：R743.33

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.015

通讯作者△，Corresponding author，E-mail：zhangyunjian66@126.com

邹潇，女，1980年生，主治医师，E-mail：23928642@qq.com