IKKɑ调控表皮角朊细胞的增殖和分化及与p63的关系

沈燕君，辛　颖，周　彤，孙小梅，姜　新*

(1.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院)



IKKɑ调控表皮角朊细胞的增殖和分化及与p63的关系

沈燕君1，辛颖1，周彤2，孙小梅2，姜新2*

(1.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院)

摘要：目的探讨IKKɑ调控表皮角朊细胞的增殖和分化及与p63的关系。方法原代分离培养野生型(wildtype，WT)和Ikkɑ基因敲除小鼠(Ikkα-/-)的表皮角朊细胞(WT-KTC及Ikkα-/-KTC)，Western blot检测Ikkα-/-中p63的表达。含0.5mM Ca2+培养基刺激分化后，免疫荧光染色观察分化标记物Zonula occludens-1(ZO-1)及增殖标记物BrdU的表达。制备沉默p63表达的慢病毒并感染Ikkα-/-KTC，观察其增殖及分化能力的变化。结果在正常培养条件下，Ikkα-/-KTC中BrdU阳性细胞率显著高于WT-KTC(P<0.05)。Ikkα-/-KTC中p63高表达。高钙条件刺激分化后，WT-KTC中BrdU表达显著降低，表达ZO-1；而Ikkα-/-KTC的BrdU表达无明显变化；且无ZO-1的表达。将表达shRNA p63的慢病毒感染Ikkα-/-KTC沉默p63后，含0.5 mM Ca2+培养基刺激细胞，Ikkα-/-KTC中BrdU的表达显著降低，不表达分化标记物ZO-1。结论IKKɑ调控表皮角朊细胞的增殖和分化，且其对增殖的调控通过p63信号通路。

关键词：IKKɑ；角朊细胞；增殖；分化；p63

(ChinJLabDiagn,2016,20:0175)

角朊细胞(keratinocytes，KTC)构成体内最大且更新最快的器官——复层上皮。角朊细胞在上皮基底层进行有丝分裂增殖，在基底上层逐步进行分化，经棘层、颗粒层、最终到角质层，不断的进行新陈代谢和自我更新[1]。因此，角朊细胞增殖与分化的平衡是维持表皮细胞稳态所必须的。

IκB激酶ɑ(IKKɑ)通常被认为是在NF-κB信号传导通路中IKK复合体的主要组成部分，是一个多功能蛋白质。在外界信号刺激下，IKK复合体被激活，调节许多基因的表达，在炎症反应、免疫反应、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物过程中发挥重要作用。在表皮，IKKɑ是一个调节角朊细胞增殖和分化的关键调节子，表现在：IKKα基因敲除(Ikkα-/-)小鼠表现出严重的皮肤发育缺陷，表皮高度增殖、增厚，颗粒层和角质层完全缺失[2]。并且IKKɑ突变参与人食管癌和头颈癌的发生。研究表明，IKKɑ对表皮增殖分化的调节作用是不依赖NF-κB信号通路的[3]，其作用的确切分子机制至今尚不明确。

p63是p53家族成员，是表皮分化早期阶段的调控因素[4]。p63主要调节表皮细胞的增殖分化，广泛分布于复层上皮的基底层[5，6]。p63的缺乏与胚胎颜面部表皮及肢端发育畸形有关。有研究表明，IKKɑ是p63的下游靶基因，参与维持基底层表皮干细胞增殖潜能[7]。p63蛋白有两种异构体：TAp63和ΔNp63，ΔNp63参与调控表皮的末端分化[8]。ΔNp63α与Ikkα启动子直接作用诱导Ikkα的表达，参与形成棘层。并且在表皮分化过程中，p63的表达降低会导致IKKɑ表达降低[7]。但也有研究显示在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中，敲除IKKα基因，会使p63的表达降低[9]。综合文献报道，在表皮中IKKα与p63的上下游关系尚不明确。因此，本课题利用体外分离培养的WT和Ikkα-/-小鼠胚胎KTC，研究IKKα对表皮增殖分化的调控作用以及与p63的关系。

1材料和方法

1.1材料Ikkα-/-小鼠由美国路易斯维尔大学赠予，C57BL/6J(野生型)小鼠购自北京维通利华实验动物中心。L.p63 shRNA.CMV.GFP.NheI、L.CMV.GFP.NheI 慢病毒载体及PspAX2、pMD2G质粒由美国路易斯维尔大学赠予。无血清培养基(keratinocyte serum-free media，SFM)购自美国Invitrogen公司；BrdU，p63，ZO-1抗体购自Santa Cruz公司。

1.2KTC的培养与分化取发育到18.5天小鼠胚胎皮肤，置于0.25%胰酶中4℃消化过夜，WT小鼠皮肤采用直接剥离的方法参考文献分离培养方法报道[10]，将表皮与真皮分离后，利用玻片轻刮表皮内侧面分离角朊细胞(WT-KTC)；Ikkα-/-小鼠由于角质层缺失，采用轻刮皮肤外表面直接获得角朊细胞(Ikkα-/-KTC)。获得的WT-KTC和Ikkα-/-KTC在低钙(含有0.02 mM Ca2+)的无血清培养基SFM中培养，培养48 h后给予高钙(0.5 mM Ca2+)刺激其分化，分别提取细胞总蛋白或4%多聚甲醛固定细胞。BrdU免疫荧光染色的细胞，固定前向培养基中加入10 μmol/L的BrdU标记90 min。

1.3沉默p63慢病毒的制备及感染KTC携带p63 shRNA 的慢病毒载体L.p63shRNA.CMV.GFP.NheI(空载体L.CMV.GFP.NheI作为对照)与病毒包装系统PspAX2和pMD2G质粒，采用磷酸钙法转染入HEK293T细胞，12 h后更换培养基，收集48 h细胞培养上清，高速离心加以纯化。获得的病毒加入角朊细胞培养基中感染细胞，48 h小时后提取总蛋白，检测目的基因的表达。

1.4免疫荧光染色固定后的切片经柠檬酸盐修复液行抗原修复后，血清封闭，分别滴加抗ZO-1、BrdU(1∶1 000稀释)的一抗， 4℃孵育过夜，洗涤后滴加荧光素二抗CY3(1∶200稀释)及DAPI，洗涤后甘油封片，显微镜下观察。

BrdU免疫荧光染色结果分析：高倍镜下随机选取10个视野，计数阳性细胞数及总细胞数；慢病毒感染后，则计数GFP标记的细胞总数及其中BrdU阳性细胞数；阳性细胞数与总细胞数的比值为BrdU阳性细胞率，实验重复3次。

1.5Western Blot检测提取角朊细胞细胞总蛋白，制胶，上样，电泳，转膜，加抗p63的单克隆抗体4℃孵育过夜，用吐温20磷酸盐缓冲液(TBST)洗3次，每次5 min，然后分别加碱性磷酸酶辣根过氧化物酶室温摇床孵育1 h，用TBST洗3次，每次5 min。用化学发光法显色，曝光。

1.6数据分析量化数据以mean±SD表示，多组间比较采用ANOVA分析，两组之间的比较采用Tukey检验，P<0.05定义为差异显著。

2结果

2.1WT-KTC及Ikkα-/-KTC增殖和分化的特性正常培养条件下，WT-KTC和Ikkα-/-KTC均呈多边形贴壁生长；该两种细胞BrdU阳性率分别见表1，Ikkα-/-KTC组BrdU阳性率显著高于WT-KTC组(P<0.05)；0.5 mM Ca2+分化条件下，WT-KTC的BrdU阳性率较正常培养条件下显著降低(P<0.05)；而Ikkα-/-KTC组与正常培养条件比较无显著差异(P>0.05)。在0.5 mM Ca2+分化条件下，WT-KTC在细胞膜上表达分化标记物ZO-1；而Ikkα-/-KTC无ZO-1的表达。

2.2Ikkα-/-KTC高表达p63Western blot 检测发现，正常培养条件下，WT-KTC及Ikkα-/-KTC中p63的表达存在差异，Ikkα-/-KTC中p63的表达显著高于WT-KTC(图1 A)。

2.3沉默P63抑制了Ikkα-/-KTC的增殖感染shRNAp63慢病毒后，Western Blot检测WT-KTC和Ikkα-/-KTC中，p63的表达均被有效沉默(图1 B)。BrdU增殖实验发现(见表1)，感染携带p63 shRNA的慢病毒后，WT-KTC和Ikkα-/-KTC的BrdU阳性率与各自的空载体组比较，均显著降低(P<0.05)。

在高钙刺激下，空载体组及p63 shRNA慢病毒感染组的WT-KTC，ZO-1表达均呈阳性；而空载体组及p63 shRNA慢病毒感染组的Ikkα-/-KTC，细胞均不分化， ZO-1表达阴性。

0.02mMCa2+0.5mMCa2+空载体组shRNAp63组WT-KTC21.35±2.2412.54±2.02#26.4±2.1213.04±2.02&Ikkα-/-KTC38.18±3.97*36.68±4.17*40.82±3.4222.68±2.17&

*vs WT-KTC组，P<0.05；#vs 0.02 mM Ca2+组，P<0.05；& vs 空载体组，P<0.05

图1　WT-KTC和Ikkα-/-KTC及感染p63 shRNA慢病毒后p63的表达

3讨论

Ikkα-/-小鼠的表皮存在严重发育缺陷，表皮细胞高度增殖，缺乏终末分化，说明IKKɑ在表皮结构和功能的维持上起关键的调节作用[2]。然而，Ikkα-/-小鼠由于表皮颗粒层和角质层的缺乏，皮肤水分快速流失，小鼠出生后迅速死亡，体内的干预实验无法进行。因此，我们取胚胎发育到18.5天(表皮发育已成熟)WT和Ikkα-/-胎鼠的表皮，在体外培养WT-KTC和Ikkα-/-KTC，经BrdU增殖实验及分化实验证实：在体外正常培养条件下，Ikkα-/-KTC增殖活性显著高于WT-KTC；且在高钙(0.5 mM)刺激分化的条件下，Ikkα-/-KTC持续表达BrdU，保持高度增殖活性，且不发生分化。说明在体外培养条件下，Ikkα-/-KTC体现了与体内相同的异常表现，可以利用其研究IKKɑ作用的分子机制。

近年来，对在皮肤发育的早期起到重要调节作用的p63研究发现[4]，IKKɑ在表皮上的作用可能与p63相关，但是关于两者作用的上下游关系，存在不同的观点[7-9]。我们的实验结果显示，WT-KTC和Ikkα-/-KTC中p63的表达存在差异，Ikkα-/-KTC p63的表达显著高于WT-KTC。说明，IKKɑ的敲除直接导致了p63的表达增高，p63很可能作为IKKɑ的下游参与角朊细胞增殖分化的调控。

为证实这一观点，我们利用慢病毒技术，将p63 shRNA慢病毒转染入Ikkα-/-KTC中，观察在纠正了Ikkα-/-KTC中p63的持续活化的状态，是否改变Ikkα-/-KTC高增殖缺分化的病理状态。实验结果2.3中显示，沉默了Ikkα-/-KTC中p63后，Ikkα-/-KTC的增殖受到明显的抑制；但Ikkα-/-KTC仍不分化(ZO-1表达阴性)。这一结果表明：p63作为IKKɑ的下游靶基因，参与调控角朊细胞的增殖；但IKKα对角朊细胞分化的调节不通过p63，有其他的信号通路或分子参与其中。本文的研究结果，为皮肤发育缺陷以及皮肤肿瘤的防治，提供新的思路和手段。

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The regulation of IKKα on the proliferation and differentiation of keratinocytes and its relationship with p63SHENYan-jun,XIEYing,ZHOUTong,etal.(KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of this study is to discuss the regulation of IKKɑ on the proliferation and differentiation of keratinocytes and its relationship with p63 pathway.MethodsThe keratinocytes was separated and cultured from wild-type (WT-KTC) and Ikkɑ knockout mice (Ikkα-/-KTC),and p63 expression was detected by Western blot in those cells.WT-KTC andIkkα-/-KTC were stimulated with the medium including high calcium (0.5 mM).It was observed and compared between WT-KTC andIkkα-/-KTC that the expression of Zonula occludens-1 (ZO-1) and BrdU by immunofluorescence staining,as well as p63 expression by Western blot.The proliferation and differentiation ofIkkα-/-KTC under the high calcium condition were evaluated after infected with the lentivirus expressed the p63-specific shRNA.ResultsUnder the normal cultured condition,the BrdU positive ratio ofIkkα-/-KTC and p63 expression were significantly higher than that of WT-KTC.With the high calcium stimulation,the BrdU positive ratio was decreased and ZO-1 expression was detected in WT-KTC,however,there was no ZO-1 expression and no change of the BrdU positive ratio inIkkα-/-KTC.When theIkkα-/-KTC were infected with the lentivirus expressed p63-specific shRNA and stimulated with high calcium,the BrdU expression was inhibited,while there was still no ZO-1 expression.ConclusionIKKɑ regulates the proliferation and differentiation of keratinocytes,and the effect on proliferation is through p63 pathway.

Key words:IKKɑ；keratinocyte；proliferation；differentiation；p63

(收稿日期：2015-12-15)

文献标识码：A

中图分类号：Q786

文章编号：1007-4287(2016)02-0175-04

*通讯作者

基金项目：国家青年科学基金项目(81201218)；吉林省科技厅国际科研合作项目(20130413032GH，20150204093SF)；吉林大学白求恩B计划(2015203,2015225)