应用动物模型研究氨基酮戊酸光动力治疗皮肤病的研究进展

张国龙 周倩 王秀丽

应用动物模型研究氨基酮戊酸光动力治疗皮肤病的研究进展

张国龙 周倩 王秀丽

氨基酮戊酸光动力疗法是一种无创、有效且不良反应和毒副作用少的治疗技术，已广泛地应用于皮肤科领域多种疾病的治疗。动物模型是研究氨基酮戊酸光动力疗法治疗疗效及机制的重要方法。近年来，通过应用皮肤肿瘤、光老化、痤疮、瘢痕以及银屑病的动物模型，优化了氨基酮戊酸光动力疗法治疗参数，进一步阐明了氨基酮戊酸光动力疗法的治疗机制，为氨基酮戊酸光动力疗法增敏剂的开发和应用提供了理论基础。

皮肤疾病；氨基酮戊酸；光化学疗法；模型，动物；小鼠；兔

氨基酮戊酸光动力治疗（ALA-PDT）是一种无创、有效且不良反应少的治疗技术［1］。临床中新适应证的开发、疗效评估、治疗参数的优化以及治疗不同疾病相关治疗机制的探讨均需借助动物模型来完成。

1 皮肤肿瘤

ALA-PDT已用于治疗皮肤鳞状细胞癌（SCC）、基底细胞癌、黑素瘤以及无色素性黑素瘤等［1］，其相关的动物模型在ALA-PDT相关研究中被广泛应用。

1.1 SCC小鼠模型：是应用于该领域最早的动物模型之一，其建模的方法主要有3种：①物理法，采用由 1根 TL 12灯管（Philips，Eindhoven，The Netherlands）和 5根 SA-1-12灯管（Wolff System，Atlanta，GA，USA）制成的日光模拟器（释放波长＞280 nm、峰值在365 nm左右的紫外光，UVA和UVB的输出功率比为9∶1）SKH-1无毛小鼠进行3倍标准红斑量（0.924 J/cm2，每周3次）进行累积照射，一般持续6个月即可在小鼠背部诱发SCC［2-3］；②化学法，在SKH-1 无毛小鼠，躯干侧面外涂50 μg/100 μl的二甲基苯蒽丙酮溶液一次，然后再用5 μg/200 μl的佛波酯丙酮溶液连续外涂，每周2次，连用20周后停用，多在停药后一段时间内，在外涂药的皮肤处会发生SCC［4］；③皮内注射法，把人皮肤SCC的A431细胞（2×106）直接皮下注射至免疫受损的小鼠真皮内，一般6～10 d后在注射处即可长出肉眼可见的瘤体［4］。前两种SCC动物模型系理化因素作用在小鼠皮肤上产生的自发性SCC模型，而后者则是异种移植性SCC模型。鉴于SKH-1小鼠在紫外线累积照射下均会发生SCC，因此，可将该小鼠模型应用到ALA-PDT预防SCC的实验研究中。Liu等［5］一方面给予SKH-1无毛小鼠每周3次的紫外线累积照射，另一方面给予小鼠每周1次的ALA-PDT治疗（经皮给药和系统给药），结果显示，ALA-PDT可有效预防和延缓因紫外线照射导致SCC的发生。ALA-PDT可有效治疗表浅或体积较小的皮肤肿瘤，对较大或较深的肿瘤疗效多不佳。为提升ALA-PDT的疗效，Anand等［4］在ALA-PDT治疗增强剂的开发和应用方面进行了系列研究。最初，他们对ALA-PDT治疗前的荷瘤小鼠进行甲氨蝶呤预处理，结果显示，无论是化学诱导或皮下接种的SCC小鼠模型，在ALA-PDT后原卟啉Ⅸ的蓄积都会得到有效提高。此后，他们又运用同样方法对骨化三醇的增效作用进行了研究，结果显示，不论是外用或腹膜内给药，只要对SCC小鼠进行了预处理都可上调小鼠体内的卟啉合成酶-粪卟啉原氧化酶和下调亚铁螯合酶，使得给予ALA后肿瘤局部的原卟啉Ⅸ蓄积量均升高10倍，因此，骨化三醇对ALA-PDT增效作用显著。不仅如此，骨化三醇的预处理还可降解肿瘤细胞内半胱天冬酶8并促进肿瘤坏死因子（TNF）α的合成，进而活化了肿瘤细胞外源性的凋亡通路，综合以上骨化三醇的预处理增加了ALA-PDT治疗后肿瘤细胞发生死亡的比率［6］。虽然用于荷瘤小鼠预处理的骨化三醇浓度很低（一般0.1～1 μg/kg），骨化三醇毒性作用几乎可忽略不计，但从骨化三醇本身的药理作用来讲，仍存在导致高钙血症的潜在风险。为进一步降低这种潜在风险，Anand等［7］又通过治疗前在食物内增加食物源性天然维生素D3的方法对荷瘤小鼠和患者分别进行研究，结果显示，不论是注射A431细胞的人体肿瘤异种移植性肿瘤动物模型小鼠还是SCC患者，其疗效都提升，且无任何不良反应，因此，值得临床推广。有作者运用日光模拟器进行造模对ALA-PDT治疗SCC的机制进行了系统的探讨，通过免疫组化分析，发现ALA-PDT可诱发肿瘤细胞的快速凋亡，治疗后TNF-α在肿瘤间质和皮下组织内高表达，且树突细胞、CD4+和CD8+T细胞的组织浸润程度也增加；证实ALA-PDT治疗可诱发肿瘤局部组织的特异性抗瘤反应，但这种特异性抗瘤免疫反应在治疗后能否长效发挥作用尚待研究［2，8］。

作者单位：200443 上海市皮肤病医院光医学治疗科 同济大学医学院光医学研究所

1.2 基底细胞癌小鼠模型：Sunar等［9］用 K5-Gli转基因的基底细胞癌小鼠模型，证实空间频域成像系统可有效检测ALA孵育后肿瘤局部PpⅨ的绝对荧光强度。Rollakanti等［10］选用 6周龄的 Ptch1+/-K14-Cre-ER p53 flox/flox基因小鼠，腹腔内注射他莫昔芬100 mg，连续注射3 d，在小鼠8周龄时给予4 Gy离子辐射，一般6～8个月时，可形成多发的基底细胞癌，利用该模型发现，骨化三醇预处理可使得ALA孵育后肿瘤局部的原卟啉Ⅸ的蓄积升高了6倍以上，此外骨化三醇还可诱导基底细胞癌的分化、增殖和凋亡，从而增强了ALA-PDT对基底细胞癌的疗效。

1.3 恶性黑素瘤动物模型：金属硫蛋白/受体酪氨酸激酶（MT-ret 304/B6）融合基因的转基因小鼠常作为恶性黑素瘤的动物模型，80%该类小鼠皮肤都表现为癌前病变样的黑变病样外观，且这些发生黑变的皮肤在1年内会发生皮肤黑素瘤，发生部位主要集中在背部、面部、背部侧面以及四肢。临床上ALA-PDT治疗恶性黑素瘤的研究一度显示出一种矛盾的结果，即黑素细胞系和黑素细胞植入的动物模型对ALA-PDT都很敏感，而自发的恶性黑素瘤患者对ALA-PDT治疗几无疗效。为了进一步验证该现象并探讨其原因，Córdoba 等［11］利用 MT-ret融合基因的转基因小鼠进了相关研究，结果证实，MT-I小鼠的黑素瘤细胞在体外对ALA-PDT确实有效，而自发于该小鼠皮肤上的黑素瘤对ALA-PDT无效，其机制可能与在体黑素瘤瘤体内的黑素阻挡了ALA-PDT的光照和在体黑素瘤浸润相对较深有关。无色素性黑素细胞瘤动物模型是通过皮下注射将无色素性黑素瘤细胞植入叙利亚金色仓鼠背部皮肤的皱褶内进行造模。Schacht等［12-13］通过系统注射和外用给药的方法分别对荷瘤的叙利亚金色仓鼠进行了ALA-PDT，以探讨不同给药方式对肿瘤微循环作用的差异，结果显示，高能量（100 J/cm2）的光动力治疗时，外用给药较系统给药对肿瘤微循环的效应更强。

2 其他皮肤病

ALA-PDT可有效改善皮肤光老化［14］。光老化造模方法是选用飞利浦公司的荧光紫外灯（波段275～380 nm，波峰310～315 nm）为光源，过滤掉短波紫外线（＜290 nm）后直接对6周龄左右的SKH-1无毛小鼠进行5～10周的累积照射，一般首次剂量从1.3个最小红斑量开始，每周增加0.5～1个红斑量，最高剂量为3个红斑量，每周3次照射，直至完成10 周的累积照射［15］。Lv 等［16］最早将光老化小鼠动物模型应用于ALA-PDT改善光老化治疗机制方面的研究，通过研究证实，在体二次谐波显微和定量胶原分析技术是评价ALA-PDT诱使胶原变化的有效方法，结合组织病理学分析，发现多次小剂量的ALA-PDT治疗光老化皮肤后，可以改变病变皮肤组织内胶原的密度和排列，从而达到皮肤年轻化的效果。其后，Park等［17］应用类似的动物模型，对ALA-PDT治疗前后的皮肤进行了组织病理学对比分析，结果显示，ALA-PDT可促进皮肤胶原在真皮内的沉积，减少真皮内的弹性纤维状物质，同时在恢复成纤维细胞形态方面还可能起直接作用，从而达到改善皮肤光老化的作用。

ALA-PDT可有效治疗痤疮，尤其适合中重度炎症痤疮的治疗［18］，但常伴严重的不良反应，如疼痛和治疗后红斑。为了避免或减少这些不良反应，Nakano等［19］运用杰克逊实验室的犀牛小鼠（hrrhhrrh）作为痤疮模型进行了研究。犀牛小鼠出生后会有较短的鼠毛长出，但4周后会出现毛发不可逆性的脱失，最终成为无毛小鼠，脱毛后残留的皮脂腺滤泡在组织学上类似人类疾病痤疮中的黑头粉刺，因此，可以把其作为黑头粉刺的疾病模型进行相关动物研究。Kosaka等［20］运用不同的ALA浓度和不同的敷药时间对该小鼠模型进行了系列的ALA-PDT治疗，结果提示，低浓度ALA（2.5%～5.0%）给药和短时间敷药（1～2 h）可以达到针对于皮脂腺的光动力疗效，为临床上减少光动力治疗痤疮过程中出现的不良反应，如疼痛和红斑提供了思路。

ALA-PDT也可治疗增生性瘢痕。新西兰大白兔的兔耳瘢痕模型是经典的瘢痕动物模型［21］。Wang等［22］选取2.0～2.5 kg的新西兰大白兔，在其每侧耳内侧分别取四处切口，大小1 cm2，手术当天切口用无菌纱布覆盖，通过3周的自然愈合会在切口处形成高出正常皮面2 mm的增生性瘢痕；通过对兔耳瘢痕治疗前后组织病理学分析以及RT-PCR研究证实，ALA-PDT可以有效抑制增生性瘢痕的形成，具体机制可能与ALA-PDT升高了增生性瘢痕局部金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂的比例，从而加速了皮损内成纤维细胞的老化以及胶原和细胞外基质的降解相关。

文献报道，外用ALA-PDT可以安全有效地治疗大面积的银屑病皮损［23］。银屑病皮损常过度增生，因此ALA能否有效吸收成为疗效的关键所在。Demerjian等［24］运用胶膜带在小鼠背部局部皮肤上反复进行浅表剥离（每天2次，共5 d），成功地在小鼠背部造成皮肤过度增生的类银屑病的皮损表现。为了改变传统ALA水溶液吸收不良的问题，在银屑病的动物模型上结合新兴材料的应用以提高ALA吸收的研究成为必要。Fang等［25］通过以上银屑病的动物模型，结合短链醇类的磷脂脂质体作为ALA的载体，以期增加ALA经皮吸收率，结果显示，应用短链醇类的磷脂脂质体作为载体，可有效增加ALA的透皮吸收，与ALA水溶液相比，在正常和过度增生的皮肤上分别提高了5和26倍，吸收的增加提高了目标组织内原卟啉Ⅸ的密度，毋庸置疑也提高了ALA-PDT的疗效。

3 结语

通过ALA-PDT治疗皮肤病相关动物模型的研究，有效优化了各种疾病ALA-PDT治疗的参数，提高了ALA-PDT的疗效并为阐明ALA-PDT治疗不同皮肤病的治疗机制提供了可能。相信随着现代医学技术的不断提高，更多相关的动物模型会被进一步开发，有助于ALA-PDT技术在皮肤科领域的应用。

［1］Wan MT,Lin JY.Current evidence and applications of photodynamic therapy in dermatology ［J］.Clin Cosmet Investig Dermatol,2014,7:145-163.DOI:10.2147/CCID.S35334.

［2］Ji J,Fan Z,Zhou F,et al.Improvement of DC vaccine with ALAPDT induced immunogenic apoptotic cells for skin squamous cell carcinoma ［J］.Oncotarget,2015,6 （19）:17135-17146.DOI:10.18632/oncotarget.3529.

［3］Wang X,Ji J,Zhang H,et al.Stimulation of dendritic cells by DAMPs in ALA-PDT treated SCC tumor cells ［J］.Oncotarget,2015,6（42）:44688-44702.DOI:10.18632/oncotarget.5975.

［4］Anand S,Honari G,Hasan T,et al.Low-dose methotrexate enhances aminolevulinate-based photodynamic therapy in skin carcinoma cells in vitro and in vivo ［J］.Clin Cancer Res,2009,15（10）:3333-3343.DOI:10.1158/1078-0432.CCR-08-3054.

［5］Liu Y,Viau G,Bissonnette R.Multiple large-surface photodynamic therapy sessions with topical or systemic aminolevulinic acid and blue light in UV-exposed hairless mice［J］.J Cutan Med Surg,2004,8 （2）:131-139.DOI:10.1007/s10227-004-0117-5.

［6］Anand S,Wilson C,Hasan T,et al.Vitamin D3 enhances the apoptotic response of epithelial tumors to aminolevulinate-based photodynamic therapy ［J］.Cancer Res,2011,71 （18）:6040-6050.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-0805.

［7］Anand S,Rollakanti KR,Horst RL,et al.Combination of oral vitamin D3 with photodynamic therapy enhances tumor cell death in a murine model of cutaneous squamous cell carcinoma ［J］.Photochem Photobiol,2014,90 （5）:1126-1135.DOI:10.1111/php.12286.

［8］Wang H,Li J,Lv T,et al.Therapeutic and immune effects of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on UVB-induced squamous cell carcinomas in hairless mice ［J］.Exp Dermatol,2013,22（5）:362-363.DOI:10.1111/exd.12132.

［9］Sunar U,Rohrbach DJ,Morgan J,et al.Quantification of PpIX concentration in basalcellcarcinoma and squamouscell carcinoma models using spatial frequency domain imaging ［J］.Biomed Opt Express,2013,4 （4）:531-537.DOI:10.1364/BOE.4.000531.

［10］Rollakanti K,Anand S,Maytin EV.Topical calcitriol prior to photodynamictherapy enhancestreatmentefficacyin nonmelanoma skin cancer mouse models［J］.Proc SPIE Int Soc Opt Eng,2015,9308:93080Q.DOI:10.1117/12.2077296.

［11］Córdoba F,Braathen LR,WeissenbergerJ,etal.5-aminolaevulinic acid photodynamic therapy in a transgenic mouse model of skin melanoma［J］.Exp Dermatol,2005,14（6）:429-437.DOI:10.1111/j.0906-6705.2005.00303.x.

［12］Schacht V,Szeimies RM,Abels C.Photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid induces distinct microcirculatory effects following systemic ortopicalapplication ［J］.Photochem Photobiol Sci,2006,5（5）:452-458.DOI:10.1039/b514128a.

［13］Kohl E,Torezan LA,Landthaler M,et al.Aesthetic effects of topical photodynamic therapy［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2010, 24 （11）: 1261-1269. DOI: 10.1111/j.1468-3083.2010.03625.x.

［14］Ji J,Zhang LL,Ding HL,et al.Comparison of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy and red light for treatment of photoaging［J］.Photodiagnosis Photodyn Ther,2014,11（2）:118-121.DOI:10.1016/j.pdpdt.2014.02.007.

［15］Peres PS,Terra VA,Guarnier FA,et al.Photoaging and chronological aging profile:understanding oxidation of the skin［J］.J Photochem Photobiol B,2011,103 （2）:93-97.DOI:10.1016/j.jphotobiol.2011.01.019.

［16］Lv T,Huang ZF,Wang HW,et al.Evaluation of collagen alteration after topical photodynamic therapy （PDT） using second harmonic generation （SHG）microscopy:in vivo study in a mouse model ［J］.Photodiagnosis Photodyn Ther,2012,9（2）:164-169.DOI:10.1016/j.pdpdt.2011.12.006.

［17］Park JY,Jang YH,Kim YS,et al.Ultrastructural changes in photorejuvenation induced by photodynamic therapy in a photoaged mouse model［J］.Eur J Dermatol,2013,23（4）:471-477.DOI:10.1684/ejd.2013.2050.

［18］Chen X,Song H,Chen S,et al.Clinical efficacy of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in the treatment of moderate to severe facial acne vulgaris［J］.Exp Ther Med,2015,10（3）:1194-1198.DOI:10.3892/etm.2015.2638.

［19］Nakano K,Kiyokane K,Benvenuto-Andrade C,et al.Realtimereflectance confocal microscopy,a noninvasive tool for in vivo quantitative evaluation of comedolysis in the rhino mouse model ［J］.Skin Pharmacol Physiol,2007,20 （1）:29-36.DOI:10.1159/000096169.

［20］Kosaka S,Miyoshi N,Akilov OE,et al.Targeting of sebaceous glands by δ-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy:An in vivo study［J］.Lasers Surg Med,2011,43（5）:376-381.DOI:10.1002/lsm.21062.

［21］Kloeters O,Tandara A,Mustoe TA.Hypertrophic scar model in the rabbit ear:a reproducible model for studying scar tissue behavior with new observations on silicone gel sheeting for scar reduction ［J］.Wound Repair Regen,2007,15 Suppl 1:S40-45.DOI:10.1111/j.1524-475X.2007.00224.x.

［22］Wang Q,Dong Y,Geng S,et al.Photodynamic therapy inhibits the formation of hypertrophic scars in rabbit ears by regulating metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase-1［J］.Clin Exp Dermatol,2014,39 （2）:196-201.DOI:10.1111/ced.12265.

［23］Kostoviĉ,Pastar Z,Ceoviĉ,et al.Photodynamic therapy in dermatology:current treatments and implications ［J］.Coll Antropol,2012,36（4）:1477-1481.

［24］Demerjian M,Man MQ,Choi EH,et al.Topical treatment with thiazolidinediones,activators of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,normalizes epidermal homeostasis in a murine hyperproliferative disease model［J］.Exp Dermatol,2006,15（3）:154-160.DOI:10.1111/j.1600-0625.2006.00402.x.

［25］Fang YP,Huang YB,Wu PC,et al.Topical delivery of 5-aminolevulinic acid-encapsulated ethosomesin a hyperproliferative skin animal model using the CLSM technique to evaluate the penetration behavior ［J］.Eur J Pharm Biopharm,2009,73（3）:391-398.DOI:10.1016/j.ejpb.2009.07.011.

The use of animal models in researches on aminolevulinic acid-based photodynamic therapy for the treatment of skin diseases

Zhang Guolong,Zhou Qian,Wang Xiuli.Department of Phototherapy,Shanghai Dermatology Hospital;Institute of Photomedicine,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200443,China

Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy （ALA-PDT）,a kind of non-invasive and effective treatment strategy with less adverse effects,has been widely applied in the treatment of various diseases in dermatology.Animal models are an important means to assess therapeutic effects and mechanisms of ALA-PDT.In recent years,the use of animal models for skin neoplasms,photoaging,acne,scar and psoriasis have optimized treatment parameters of ALA-PDT,further clarified therapeutic mechanisms of ALA-PDT,and provided theoretical basis for the development and application of sensitizers in ALA-PDT.

Skin diseases;Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Models,animal;Mice;Rabbits

Wang Xiuli,Email:wangxiuli20150315@163.com

2015-10-13）

国家自然科学基金（81201222、81472538）；上海市自然科学基金（15411950302）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81201222、81472538）;Shanghai Municipal Natural Science Foundation （15411950302）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.05.014

王秀丽，Email:wangxiuli20150315@163.com