呼吸道病原体分子诊断技术研究进展

邸红芹，王晓玲(综述)，王 亮，张 辉(审校)

(1.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041；2.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 064000；3.河北省胸科医院呼吸内科，河北 石家庄 050041；4.河北省胸科医院办公室，河北 石家庄 050041)



·综 述·

呼吸道病原体分子诊断技术研究进展

邸红芹1，王晓玲2(综述)，王 亮3，张 辉4*(审校)

(1.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041；2.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北 唐山 064000；3.河北省胸科医院呼吸内科，河北 石家庄 050041；4.河北省胸科医院办公室，河北 石家庄 050041)

呼吸道感染；病原体；分子生物学诊断技术

呼吸系统是人体各个系统中与外环境接触最频繁的系统之一，在一些较差环境中很容易导致呼吸道感染，呼吸道感染也是临床上最常见的感染性疾病[1]。呼吸道感染性病原体来源多样，包括病毒、细菌、衣原体和支原体等，并且传播迅速，临床表现相似，单从临床表现很难区分感染病原体，易造成误诊、贻误病情和抗生素滥用[2]。传统的检测方法有病原体分离培养法和免疫检测法，由于其操作过程繁琐、灵敏度低以及检测时间较长，无法满足快速诊断的要求。近年来，随着分子生物学的发展，检测病原体的方法也在不断进步，为临床呼吸系统疾病的诊断和治疗提供了很大的帮助。现就呼吸道病原体的分子生物学检测方法及研究进展综述如下。

1 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)

PCR技术是近年来广泛用于临床病原体检测的一种有效手段，是PE Cetrus公司于1985年开发的一种体外快速扩增目的片段的专利技术，该方法特异、灵敏、快速且可使某些不能分离培养或难以培养的病原体得以鉴定[3-4]。随着PCR技术的发展，多重和实时荧光定量技术不断应用于呼吸道病毒的检测，使病原体鉴定发展更快。多重PCR技术即在单一PCR体系中加入两对以上特异性引物，能同时扩增多个靶基因片段，根据不同靶基因片段的大小判定结果，在一个反应体系中可同时鉴定多种病原体。该方法为定性检测，但快速灵敏、操作简单，适合于在临床医学领域广泛应用。Mo等[5]纳入50例临床样本，采用多重RT-PCR法和荧光定量PCR法快速筛查甲型H1N1流感病毒、新型甲型流感病毒和乙型流感病毒，2种方法检测结果一致率为100%。靶序列富集多重PCR技术(Tem-PCR)，针对目的基因设计两对特异的巢式引物，经过富集、加标签和扩增3个阶段，能够在同一体系中快速、特异和高通量地诊断多种呼吸道病原体。Hassoun等[6]采用Tem-PCR技术检测22种常见呼吸道病毒及19种细菌，该实验纳入了200份咽喉拭子标本(冬季和夏季各100份)，冬季收集的标本中，单一病毒和细菌感染的标本分别为11份和34份，其中检出率最高的有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、莫拉菌和冠状病毒；夏季收集的标本中有37份样本存在至少一种细菌感染，4份样本存在多种病毒感染，其中检出率最高的有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。

多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)技术为多重PCR与荧光定量PCR相结合，实现了单一体系中多种病原体的并行定量检测，可用于病原体的快速初筛及预防医学的健康人群体检。向蕾等[7]根据4种呼吸道病毒(人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒及热呼吸道合胞体病毒)的保守序列建立多重荧光PCR快速检测体系，体系优化后，检测灵敏度为10 copies/μL，对临床样本检测的特异度为100%，表明该体系可以快速准确地检测这4种呼吸道病毒，且重复性良好，特异度高。王玉月等[8]探讨MRT-PCR在9种常见呼吸道病原体检测中的价值，该研究纳入了204例临床标本进行回顾性检测，包括副流感病毒1、2、3 型，以及肺炎支原体、肺炎衣原体、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞体病毒。实验结果显示MRT-PCR的最低检出限为103copies/mL，特异度达100%，无交叉反应，且检测结果与其他试剂报告结果完全一致。表明MRT-PCR具有快速、准确、特异度高等特点，在呼吸道病原体检测方面有重要价值。

2 基因芯片技术

基因芯片技术基于DNA/RNA分子杂交原理，靶序列能与固定在不同材料上的寡核苷酸片段相配对，同时借助一定的荧光检测系统检测待测标记样品的杂交信号，并通过计算机系统对交信号进行分析和处理，从而快速得出待测品的基因序列及表达的信息。芯片技术在各种病原体的高通量检测及基因分型领域有广泛的应用，主要包括传统的固相芯片、液相芯片及微流控芯片。

2.1固相芯片 传统的固相芯基于DNA/RNA杂交技术，根据病原体序列设计特异的寡核苷酸单链点样于微阵列芯片上，提取待测样本的核酸，经体外扩增、探针标记和靶序列杂交3个步骤处理，最后根据荧光信号判定检测结果。此外，根据通量的需求，固相芯片技术可与多种技术联合建立快速、高通量和自动化的检测平台，如ArrayTubeTM(AT，Germany)系统是基于多重PCR技术而建立的一种新型的酶标记、低密度、低消耗的芯片[9]；FilmArray分子诊断平台是集提取、扩增、产物处理及数据分析为一体的全自动检测系统，且在1 h内可完成检测，该平台已通过FDA认证，用于检测15种呼吸系统病毒和几种呼吸道病原菌[10]。最近，基于扩增子拯救PCR技术(Arm-PCR)的iCubate检测系统已经上市，该技术克服了多个靶点扩增条件不兼容，并创新性设计了一次性全封闭卡盒，以及配套的卡盒处理仪、阅读仪及控制软件。目前，该平台已开发出包括呼吸道病原体V组(20种)、呼吸道病原体B组(9种)、流感病毒分型(8种)、医院获得性病原体(14种)、分枝菌属(13种)及葡萄球菌(9种)等多重PCR检测试剂盒。iCubate全自动多重微生物核酸检测系统具有多重、自动、封闭、快速、随机、灵敏等技术特点，适合应用于疾病预防控制机构、出入境检验检疫部门，用于开展病原体筛查、院内感染监测、环境监测、检验检疫工作、食品卫生检验工作，还适用于遗传病基因突变检测、mRNA和miRNA表达图谱研究、免疫组库多样性分析等诸多领域。

2.2液相悬浮芯片 液相芯片(悬浮阵列芯片)技术是一种以荧光编码微球为核心，可以同时标记100种不同比例颜色配置的荧光微球，应用激光检测和流式细胞仪实现高分辨率和自动化，具有高灵敏度、高通量和并行检测等特点；在核酸研究方面，常用于单核苷酸多态性基因分型、遗传疾病筛选、基因表达分析，以及微生物检测分析，其代表技术为Luminex公司研制的xMAP技术[11]。目前，基于xMAP技术和Luminex仪器，开发了3种商业化诊断试剂盒：Luminex公司基于靶位特异性引物延伸技术研发的xTAG试剂盒，该试剂盒已获FDA认证(为多种呼吸道病毒诊断试剂盒)；凯杰公司开发的与xTAG原理类似(靶位特异性延伸技术)的ResPlex试剂盒；EraGene公司基于靶序列富集多重PCR技术开发出来的MultiCode-PLx RVP试剂盒[12-13]。这些试剂盒使用便捷且具有较高的灵敏度，但它们都是开放性平台，易于产生污染，同时靶序列多重PCR扩增限制了单管反应检测的病原数量[14]。

2.3微流控芯片 20世纪90年代，微全分析系统的出现，通过化学分析将设备微型化与集成化，最大限度地将分析实验室的功能转移到便携的芯片中，实现“芯片实验室”的构想。微流控分析芯片通过微机电加工技术将整个实验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在几平方厘米的微流控芯片上，且可多次使用，因而极大地减少了样品和分析试剂的用量，降低了分析的成本，加快了分析的速度，具有广泛的适用性。文小霞等[15]运用微流控芯片分析方鉴定多重细菌，细菌进样、培养和鉴定都在芯片上实现，同时结合培养池阵列的空间分辨力以及菌种特异性显色培养基的颜色分辨力实现多重细菌检测；该实验采用4种常见泌尿系统感染病原菌作为模拟测试对象，结果显示该方法在15 h内可完成细菌鉴定，检测限可达10 cfu/mL；此外，临床样本分析表明，该方法可以实现4种细菌同步鉴定，与传统方法相比符合率为 96.3%。这种微流控细菌鉴定方法简便快速，有望发展成为细菌检测的有力工具。

3 核酸恒温扩增技术

核酸恒温扩增技术是一种新型的体外核酸扩增技术，其扩增反应始终在一个温度下进行，反应快速、操作简便、检测灵敏度高，在呼吸道病原体检测方面环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依赖核酸序列等温扩增(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)和森巴(simple amplification based assay，SAMBA)等恒温扩增技术运用较为广泛[16]。

LAMP技术是一种基于链置换酶扩增核酸等温扩增技术，能特异、高效、快速地扩增DNA，适宜病原体的快速分子生物学诊断，该技术在2000年由Notomi等报道。罗思思等[17]基于LAMP技术建立了禽流感病毒H7亚型和N9亚型的快速检测方法，结果显示该体系在63 ℃反应1 h就能特异地检测禽流感病毒H7亚型和N9亚型，对其他亚型禽流感均无扩增，且最低检测限为10 copies/μL。刘毅等[18]选择121例临床疑似结核患者痰液标本，建立LAMP检测体系并评价其检测能力，其特异度为92.16%，灵敏度为87.14%。表明该方法能够快速准确地检测结核分枝杆菌，适于基层医院结核病诊断的推广和应用。NASBA是一项以核酸为模板并能实时观测结果的快速等温扩增技术,由2条特别设计的寡核苷酸引物介导、3种酶(逆转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶)催化，在2 h内将模板RNA扩增109-12倍，扩增速率和灵敏度要高于常规PCR。杨海鸥等[19]建立了一种基于NASBA技术检测呼吸道合胞病毒的新方法，其检测灵敏度要显著高于RT-PCR，至少比RT-PCR高出2个数量级；临床样本检测表明该方法可特异地扩增呼吸道合胞病毒的目的片段，对其他病毒均无扩增；该方法克服目前实验室病毒检测方法的局限性，为呼吸道病毒的检测提供快速有效的实验室诊断方法。SAMBA是一种新型、快速检测病毒载量的方法，该方法基于恒温扩增和可视化纸片技术，能够在1.5 h内得出诊断结果，且只需要普通的检测仪器，对实验员的要求也不高，适用于临床和社区门诊的快速检测。

4 高分辨率熔解曲线技术

高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)技术是基于饱和荧光染料结合的双链DNA在温度升高的过程中会形成不同形态熔解曲线而发明的一种新型分子诊断技术，该技术于2003年由美国Utah大学Wittwer实验室首次提出[20]。由于其高灵敏度和分析速率，HRM技术在遗传位点、疾病相关性及病原体检测方面应用较广。赵焕英等[21]运用聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)技术检测患者下呼吸道分泌液中菌群种类，根据扩增得到的不同HRM图型与经过测序鉴定的菌株进行对比，结果显示PCR-HRM技术能够特异、快速区分下呼吸道中不同细菌16S V3区。有研究根据嗜肺军团菌16S rRNA基因保守序列应用PCR-HRM法进行检测鉴定，该方法最低检出浓度为0.1 pg/μL，在117例患者样本中检测出3株嗜肺军团菌，与基因测序法结果一致[22]。基于HRM技术原理，市场有一些相关的商品化试剂盒，如获得欧盟体外诊断医疗设备认证的RespiFinder-SMART-22试剂盒[23]，能够一次性检测22种呼吸道病原体(18种病毒和4种细菌)，其体系中包含一份极具竞争力的内部扩增控制，具有单一实时荧光定量PCR的灵敏度，且能在核酸提取后4 h出检测结果。

5 测序技术

呼吸道病原体最精确的鉴定方法就是获得该病原体的整个基因组信息。2005年454公司基于焦磷酸测序法推出了高通量基因组测序系统，其能够在短时间内多样本、高通量地获得基因组信息，被Nature杂志以里程碑事件报道。Bialasiewica等[24]运用Solexa平台检测4例临床患者和1例健康对照咽拭子标本，48 h内测出5.9×105条序列信息，其几乎涵盖所有病原体的核苷酸信息，同时该技术一直用于检测未知病原体，如副流感病毒4的发现。然而大多数临床实验室对这项技术没有足够的认知，尤其是大量的测序数据需要有专业的生物信息学人员进行分析，目前还不能在一线临床机构进行推广。当然，未来高通量测序技术将会是呼吸道病原体诊断发展的趋势。

6 其他技术

变性高效液相色谱技术由Oefner等在1995年提出，即把接近DNA解链温度条件下进行的离子对反向色谱分析，是一种新型核酸检测分析技术，具有分辨率高、自动化、高通量和成本低等优势。陈茹等[25]建立多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核分枝杆菌复合群特异性IS6110和IS1081插入序列，其具有很高的特异度，检测灵敏度达到每个反应102基因拷贝，该法临床检测可缩短至24 h之内。反向斑点杂交技术是一种结合基因扩增和分子杂交的基因诊断技术，由Saiki等提出，其原理先将特异性探针固定于膜上，再将待测的DNA样本(一般为特异性的PCR产物，并预先对PCR引物5′端进行生物素标记，使扩增产物相应的带有生物素标记)与之杂交，探针与待测样本DNA单链通过碱基互补配对的原则相结合，凡是与待测DNA样本结合的探针均带有生物素标记，加入亲和素偶联的酶后，通过酶底物结合进行显色，进而判断杂交结果。蒋莎莉等[26]利用反向斑点杂交技术检测97例病理石蜡组织中结核分枝杆菌，与荧光定量PCR及抗酸染色相比，反向斑点杂交技术具有较高的灵敏度和阳性检测率。质谱分析技术能够提供大量可靠地蛋白、核酸信息，越来越多地用于病原体分子诊断。质谱分析技术能够与各种色谱分析及其他诊断技术结合，可大大提高其灵敏度，如质谱分析技术与纳米技术相结合可以检测痕量靶向病原体。生物传感技术利用目标检测物与生物感应原件之间相互作用产生响应信号，通过对信号的处理、分析实现目标物检测。表面增强拉曼光谱术能够从分子水平检测吸附在金属表面的物质并提供物质独特的指纹振动峰，进行高特异度、高灵敏度和高精确性的检测分析。

呼吸道病原体的快速诊断是临床治疗的关键，常规的细菌学检测仍是重要的实验室诊断“金标准”，但检测的灵敏度有很大的缺陷，容易出现假阴性，且一些不易培养的病原体检测步骤非常复杂。分子生物学技术是快速有效的检测方法，具有很高的灵敏度和特异度，在呼吸道病原临床诊断上具有良好的应用前景。总之，随着病原体诊断技术研究的不断深入，对于指导临床规范用药以及减少疾病传播有着深远意义。

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(本文编辑：刘斯静)

2016-09-23；

2016-10-18

河北省医学科学研究重点课题(20150147)

邸红芹(1973-)，女，河北深泽人，河北省胸科医院副主任检验师，医学硕士，从事临床检验学研究。

*通讯作者。E-mail：zhanghui_4081@sina.com

R517.6

A

1007-3205(2016)12-1485-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.032