石家庄市210例先天性耳聋青少年耳聋基因检测及分析

张学梅，董 梅，赵 宁，刘 辉，毛轶楠，周鲲鹏

(1.河北省石家庄市第一医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第三医院手术室，河北 石家庄 050051；3.河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050000)



·论 著·

石家庄市210例先天性耳聋青少年耳聋基因检测及分析

张学梅1，董 梅2，赵 宁1，刘 辉1，毛轶楠3，周鲲鹏1

(1.河北省石家庄市第一医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第三医院手术室，河北 石家庄 050051；3.河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050000)

目的了解石家庄市先天性耳聋青少年遗传性耳聋的发病情况。方法采用聚合酶链反应及限制性内切酶方法，对石家庄市5所特殊教育学校210例先天性耳聋青少年进行基因检测。结果210例耳聋患者中共有82例携带易感突变基因，总突变率为39.05%。其中GJB2基因235delC纯合突变23例(10.95%)，杂合突变20例(9.52%)；PDS基因IVS7-2A>G纯合突变13例(6.19%)，杂合突变为22例(10.48%)；线粒体12sRNA DNA A1555G阳性突变为5例(2.38%)。结论石家庄地区先天性耳聋青少年遗传性耳聋的发病率较高，以GJB2基因235delC位点突变为主，其次为PDS基因IVS7-2A>G。部分听力正常者也携带致聋易感基因。

耳聋；突变；线粒体

听觉障碍是影响人类健康的主要疾病之一,根据世界卫生组织最新资料显示，目前世界上约2.5亿听力障碍患者，我国听力障碍患者已经超过2 700万，并且有逐年增加的趋势。在西方国家，每1 000例新生儿中就有1～2例婴儿患有重度先天性感音神经性耳聋，5岁以前的发病率可增加至2.7/1 000～3.5/1 000，其中有2/3是由遗传因素所致[1]。目前由于认知的局限性，对遗传性耳聋的治疗尚无有效的治疗方法。对危险人群做到早筛查、早发现、早治疗，并给予专业的咨询管理是解决问题的关键。针对这一问题，石家庄市第一医院对石家庄地区部分先天性耳聋青少年进行分子遗传学筛查，结果显示石家庄地区耳聋患者GJB2 235delc、PDSIVS7-2A>G和线粒体DNA 12sRNA A1555G突变率均较高。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年3月—2015年12月石家庄市5所聋哑学校共210例先天性耳聋青少年，排除其他遗传性疾病。调查耳聋患者的基本信息、耳聋史、家族史、聋儿出生史、个人史(耳聋前传染病、耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等)。进行全身及专科查体。行纯音测听。向家长解释聋病基因筛查的意义和目的，让家长了解耳聋基因检测的必要性，填写知情同意书。经家长同意后收集每位患者的基本资料和血样。210例耳聋患者男性110例，女性100例，年龄8～29岁，平均(14.5±5.7)岁，均为汉族。其中非综合征性耳聋为207例，Waardenburg综合征3例。均无脑膜炎、中耳炎、腮腺炎等病史，无母孕期异常和出生时乏氧及早产等病史，无智力障碍，聋前无明确头部外伤史。

1.2DNA提取 所有入选人员均经肘静脉抽取外周血5～6 mL，乙二胺四乙酸抗凝管保存，应用试剂盒提取DNA(山东三月三基因技术有限公司)，提取步骤和方法参照试剂盒提供的使用说明进行。取适量提取DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测，其余于-80 ℃保存备用。

1.3检测方法 应用聚合酶链反应及限制性内切酶方法进行检测。

1.3.1试剂 GJB2 235delc突变、PDSIVS7-2A>突变检测试验为：2×PCR反应液、阴性对照DNA、纯合突变阳性对照DNA、杂合突变对照DNA、酶切鉴定试剂；线粒体DNA12sRNA A155G的酶切鉴定试剂为：HaeⅢ限制性内切酶缓冲液、HaeⅢ限制性内切酶，其他与GJB2突变检测试剂相同(所有试剂均为山东三月三基因技术有限公司提供)。

1.3.2扩增体系配制 2×PCR反应液10 μL，水7 μL，分别加入对照DNA及待检样本DNA 3 μL，无模板对照加水3 μL，总反应体系20 μL。

1.3.3扩增条件 保温42 ℃，5 min；94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s；复性58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30个循环；再延伸72 ℃，5 min；4 ℃保存。

1.3.4GJB2及PDS酶切体系配制 PCR扩增产物10 μL，酶切鉴定试剂10 μL，总量20 μL体系。酶切条件：37 ℃水浴15 min。线粒体酶切体系配制：PCR扩增产物10 μL，HaeⅢ限制性内切酶缓冲液2 μL，HaeⅢ限制性内切酶1 μL，水7 μL，总量20 μL体系。酶切条件：37 ℃水浴1 h。

1.3.5琼脂糖凝胶电泳检测 2%琼脂糖凝胶，酶切产物上样量为8 μL，以电场强度为85 V电压，进行恒压电泳，时间为45 min。通过凝胶电泳成像分析仪进行样本PCR产物酶切后图像扫描观察结果。

GJB2 235delc纯合突变：出现940 bp条带，与阳性对照DNA酶切片段泳动距离一致；GJB2 235delc杂合突变：出现940 bp、580 bp和360 bp 3条带，与杂合对照DNA酶切片段泳动距离一致；GJB2 235delc野生阴性：出现580 bp和360 bp 2条带，与阴性对照组DNA酶切片段泳动一致。

PDSIVS7-2A>G纯合突变：出现190 bp条带，与阳性对照DNA酶切片段泳动距离一致；PDSIVS7-2A>G杂合突变：出现190 bp和240 bp 2个条带，与杂合对照DNA酶切片段泳动距离一致；PDSIVS7-2A>G野生阴性：出现240 bp条带，与阴性对照组DNA酶切片段泳动距离一致。

线粒体DNA A1555G阳性突变：出现91 bp条带，与阳性对照DNA酶切片段泳动距离一致；线粒体DNA A1555G野生阴性：出现111 bp条带，与阴性对照组DNA酶切片段泳动距离一致。

2 结 果

2.1听力检测结果 全部研究对象由专业人员进行纯音测听检查，按世界卫生组织(1980)国际标准，210例听障患者均为双侧重度-极重度感音神经性耳聋(听力损失均在70 dB以上)。24例听力正常者听阈均为25 dB以下。

2.2PCR扩增及限制性内切酶酶切结果 210例耳聋青少年检测对象中共82例发生了基因突变，总突变率为39.05%。其中GJB2基因235delC双等位基因纯合突变23例(10.95%)，单等位基因杂合突变20例(9.52%)；PDS基因IVS7-2A>G双等位基因纯合突变13例(6.19%)，单等位基因杂合突变为22例(10.48%)；线粒体DNA A1555G阳性突变为5例(突变率为2.38%)。210例患者中有2例为GJB2基因235delC及PDS基因IVS7-2A>G单等位基因复合杂合突变。

3 讨 论

耳聋是一类发病率高、病因复杂、给患者和社会家庭带来沉重负担的疾病。耳聋的影响因素主要分为环境和遗传因素。目前随着环境因素导致的耳聋发病率的降低和对耳聋诊断水平的提高，已经确定60%的耳聋是由遗传缺陷引起，遗传因素是导致耳聋的首要因素[2-3]。遗传性聋分为非综合征性耳聋(non-syndromic hearing impairment，NSHI)和综合征性耳聋(syndromic hearing impairment，SHI)。其中70%为NSHI，临床表现为单纯的感音神经性聋，除听力受损外基本无其他异常；其余30%为SHI，临床表现多样，除听力损失外，常伴有全身其他器官的病变。本研究210例耳聋患者中207例患者为单纯耳聋患者，除耳聋外，无其他异常表现；还有3例为Waardenburg综合征，除遗传性耳聋外，同时伴有智障、眼距增宽和额部少量白发。

遗传性NSHI根据遗传特征可分为4种：常染色体隐性遗传性耳聋、常染色显性遗传性耳聋、线粒体DNA相关遗传性耳聋及X-连锁相关性遗传性耳聋。其中以常染色体隐性遗传性耳聋最为常见，约占非综合征遗传性耳聋总发病率的80%，常染色体显性遗传约占20%，X-连锁及线粒体DNA相关耳聋占1%～2%[4]。目前已确定GJB2基因突变占常染色体隐性遗传性聋病例中的比例为34%～50%。GJB2突变位点多样，且有明显种族特异性[5]。研究已经发现233～235 delc突变是东亚地区最常见的突变。本研究结果显示石家庄地区210例样本中有43例为GJB2 235 delc突变，突变率为20.48%，与文献报道国内其他地区发病率相当[6-10]。GJB2 235delc纯合突变患者临床表现为自幼极重度感音神经性耳聋，尽管认知能力、数学和阅读能力的下降与耳聋无直接关联，但是因为重度-极重度听力障碍，这些患者学习言语、数学及阅读的能力大大受到限制，如果不干预，多数患者会成为聋哑人，尽管单纯教育性的干预可部分弥补因听力障碍带来的问题，但是从根本上解决这些问题只有尽早诊断、尽早植入人工耳蜗才能提高GJB2耳聋患者认知、阅读、语言能力。因此，对于GJB2突变检测阳性患者应尽早诊断、尽早干预、尽早植入人工耳蜗是治疗的关键[11-12]。

PDS即SLC26A4基因，是另外一个最常见的引起NSHI的基因，可导致前庭导水管扩大及耳聋。在我国导致前庭导水管扩大或前庭导水管扩大伴Mondini畸形最常见的原因是PDS IVS7-2A>G突变，其次为PDS A2168G，C1229T突变。本研究结果显示由PDSIVS7-2A>G突变占所有耳聋患者的比率为16.67%(35/210)，与国内其他地区相当[9,13-15]。对于这一类患者，早期诊断，通过告知患者避免感冒、头部剧烈活动、头外伤等情况可延缓耳聋的进展，发现听力下降尽早佩带助听器，可帮助部分儿童获得有效的听力补偿，如已发展成为重度感音性耳聋，尽早植入人工耳蜗可帮助其重获听觉功能、保持学习语言及言语交流的能力，达到聋而不哑。

线粒体突变也是导致耳聋的众多原因之一，在线粒体DNA中可导致耳聋的突变主要是12SrRNA的A155G、C1494T、T1095C、961delC及A827G等，其中以A155G最为常见，常伴有其他位点联合突变[14,16]。12SrRNA基因突变是氨基糖苷类抗生素诱导的感音神经性耳聋的热点。本研究结果提示线粒体DNA12SrRNA的A155G占石家庄地区先天性青少年耳聋的比率为2.38%(15/210)。对于携带这一基因突变的患者，预防使用氨基糖甙类抗生素能有效避免耳聋事件发生。

本研究首次报道了石家庄地区遗传性耳聋的发病情况，结果提示在石家庄地区引起耳聋的主要原因为GJB2突变，其次为PDS基因，线粒体突变也占小部分比例。以上数据可为该地区耳聋患者的诊治提供依据，更重要的是通过对突变基因的筛查，对于携带耳聋基因的家庭先分析耳聋患者及其父母的基因型，再为后代作出耳聋患者的风险系数[5]，为患者家族内成员的婚育提供指导意见，结合婚前或产前检查可以避免耳聋患儿出生，而且研究已经证实产前通过检查胎儿DNA来对某些遗传性耳聋进行产前诊断在技术上是可行的[17-19]。因此，在人群中(包括重点人群和普通人群)进行耳聋基因筛查是十分必要和迫切的，建立全国和地方遗传性耳聋防治机构将是未来耳聋防治工作的关键。但本研究仅对最常见的3个基因3个位点进行检测，数据上尚不全面，我们将在今后的研究中完善和补充其他常见耳聋基因及位点检测，从而为遗传性耳聋的诊治提供新的资料。

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(本文编辑：许卓文)

2016-03-23；

2016-07-22

石家庄市科学技术研究与发展指导计划(141462573)

张学梅(1978-)，女，湖北黄冈人，河北省石家庄市第一医院副主任医师，医学博士，从事耳鼻咽喉疾病诊治研究。

R764.431

B

1007-3205(2016)12-1448-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.021