痰热清联用万古霉素降低对MRSA的防耐药突变浓度的体外研究

陈洋 张文平 佑航标 荆珊珊 马利军

痰热清联用万古霉素降低对MRSA的防耐药突变浓度的体外研究

陈洋 张文平 佑航标 荆珊珊 马利军

目的探讨痰热清联用万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的防耐药突变浓度的影响。方法采用琼脂二倍稀释法测定万古霉素单用以及联合痰热清MRSA的最低抑菌浓度(MIC)、防止耐药突变浓度、选择指数(SI)。结果万古霉素、痰热清对MRSA的防突变浓度(MPC)分别为1 μg/ml、500 μl/ml；联合痰热清时万古霉素对MRSA的MPC为0.5 μg/ml。结论痰热清联合应用可降低单药对MRSA的MPC,缩小SI,有效的防止耐药菌的富集。

痰热清；万古霉素；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；防耐药突变浓度

在抗感染治疗领域正面临着前所未有的挑战,细菌耐药状况日益严峻,耐药菌感染严重威胁着公众健康。由于万古霉素耐药菌株的出现及肾毒性等副作用,给临床治疗带来很大的困难。中草药在治疗细菌感染方面逐渐受到重视,具有抗菌作用的中药制剂正不断得到研究与证实,因此探究中药对MRSA的抗菌效果是非常必要的。MPC和SI概念的提出对临床应用抗菌药物提出了新的要求,也为研究耐药机制开辟了新的领域。研究体外测定痰热清联用不同浓度的万古霉素对MRSA有不同程度的抑制作用,这为临床上从中药途径解决MRSA耐药性问题提供思路。通过协同治疗,既提高疗效,又缩短万古霉素使用时间和剂量,从而将万古霉素的不良反应控制到最低。

1 材料与方法

1.1 菌株 MRSA菌株ATCC43300由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 MH培养基、药物 MH琼脂(OXOID)、MH肉汤(北京索莱宝生物科技有限公司)、万古霉素(中国食品药品检定研究院)、痰热清注射液 10ml(上海凯宝药业股份有限公司)。

1.3 测定MIC方法 用倍比稀释法配制琼脂平板,将MRSA ATCC43300在MH琼脂上复苏,然后用接种环挑取2～3个菌落接种于MH肉汤中,37℃培养6 h,制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液(约1.5×106cfu/ml),用多点接种仪接种于含2倍稀释的万古霉素单药及两药MH琼脂平板上每点含菌104 cfu,37℃培养18 h后观察记录MIC结果。

1.4 MIC结果判断 结果根据美国临床实验室标准化机构(CLSI)2015年标准,以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。

1.5 测定MPC方法 将MRSA菌株在MH培养基上过夜培养,挑取过夜培养的菌落接种于200ml MH肉汤中,37℃震荡(200次/min)培养6 h后,离心后弃上清液,再次重复以上操作,然后挑取菌落置于MH肉汤中,将菌液浓度调整为3.0×106cfu/ml。用移液枪取100 μl菌液,用L型玻璃棒将菌液均匀涂抹在倍比稀释抗菌药物的平板上,37℃温箱培养72 h后,没有菌落生长的最低药物浓度为初测MPC(MPCPr)。用上述方法测定MPCPr后,依次递减(20%)抗菌药物浓度,配制含药浓度范围为MPC到1/2范围的琼脂平板,重复MPCPr测定时的方法,测定72 h无菌落生长的最低药物浓度定为MPC。

1.6 配制含药琼脂平板 ①用二倍稀释法分别配置含有痰热清及万古霉素的琼脂平板：将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解,并在45～50℃水浴中平衡的MH琼脂中,充分混匀倾倒灭菌平皿,琼脂厚度3～4mm。所配含万古霉素琼脂平板浓度为0～64.0 μg/ml、痰热清浓度为0～1000.0 μl/ml,制备每个浓度各4个平板。②含联合用药琼脂平板的配制：以万古霉素和痰热清单药的MIC值、MPC值为基准,将定量的万古霉素加入100mm平皿中,然后再将倍比稀释的痰热清溶液加入,余步骤按照配制单药琼脂平板的方法操作,制备每个浓度各4个平板。

1.7 根据实验室所测得的万古霉素、痰热清及联合用药对MRSA的MIC、MPC计算SI。比较单用及联合用药的关系并分析。

2 结果

2.1 万古霉素对MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分别为0.5 μg/ml 、1 μg/ml、2。

2.2 痰热清对MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分别为125 μl/m 、500 μl/ml、4。

2.3 与痰热清联用可使万古霉素对MRSA ATCC43300的MPC和SI较前减小,联合应用痰热清浓度达到125.0 μl/ml,万古霉素的MPC可减少到0.5 μg/ml,SI完全关闭。见表1。

表1 联用不同浓度的痰热清后万古霉素对MRSA的MPC和SI

2.4 与万古霉素联用可使痰热清对MRSA ATCC43300的MPC、SI明显减小,当联用浓度达到0.5 μg/ml,痰热清的MPC即可减少到125 μl/ml,SI完全关闭。见表2。

表2 联用不同浓度的万古霉素后痰热清对MRSA的MPC和SI

3 讨论

MRSA在目前医院感染中占有比例约为30%。国外报道出现万古霉素中介及耐药菌株,国内尚无万古霉素耐药菌株报道。MRSA感染治疗代价高。有学者认为导致万古霉素失败的原因很可能是MIC的漂移［1］现象。从 SI 理论分析: MRSA耐药率之所以上升,可能是由于体内药物浓度处于细菌的SI之间(MIC和MPC间的药物浓度范围),耐药突变株容易被选择性富集扩增而产生耐药。SI(MPC/MIC)为临床提供了一个新的疗效衡量标准,用于比较药物选择耐药菌株的能力；当联合应用两种抗菌药物时,并同时处于各自的 MIC值以上时,细菌需要同时发生两种耐药突变后才能被选择性富集,从而关闭或缩小 SI。通过联合用药虽然可以缩窄或者关闭SI,但是另一抗菌药物的使用很有可能引起其他的耐药突变,就限制了为缩小药物的SI采取两种抗菌药物的联合应用。在这种情况下人们将注意力转向天然药物。近年来关于中药抗细菌耐药性的研究备受关注,通过查阅资料发现痰热清在临床上具有明显的抗感染效果,药理研究结果表明,该药不仅有清热、解毒、消炎、杀菌的作用,而且可以增强白细胞的吞噬,提高机体免疫调节作用［2］。张世有等［3］研究结果表明痰热清注射液结合西医基础治疗社区获得性肺炎较单纯西医治疗疗效好。宋志香等［4］研究结果表明：痰热清注射液与万古霉素注射液具有协同抗菌作用,对治疗MRSA感染肺炎具有良好疗效。

通过初步探讨了痰热清与万古霉素联合对MRSA的MPC的影响,证实此种联合用药能降低万古霉素的MPC,缩小SI,有效的防止耐药菌的富集。这为临床应用万古霉素治疗MRSA感染,减少耐药菌株的出现提供了理论依据。但是考虑到体内环境复杂,与体外研究存在一定的差异,因此尚需进行动物和临床实验进一步验证联合用药时药物代谢动力学与耐药突变体选择的关系。

［1］Juan-Ignacio A,Ana GC,Paloma GH,et al.Vancomycin MICs did not creep in Staphylococcus aureus isolates from 2002 to 2006 in a setting with low vancomycin usage.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2008,62(4):773-775.

［2］王琴,潘静.痰热清注射液的药理作用和临床应用.华北国防医药,2010,22(1):41-43.

［3］张世有,李冬生.痰热清治疗社区获得性肺炎60例临床观察.黑龙江中医药,2011,40(3):19-20.

［4］宋志香,李刘坤,李兴广.中药痰热清注射液治疗MRSA感染性肺炎的临床观察研究.中华医院感染学杂志,2010,20(11): 1596-1598.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.115

2016-02-02］

450000 河南中医药大学(陈洋 荆珊珊)；河南省人民医院呼吸与危重医学科(陈洋 张文平 佑航标 荆珊珊马利军)；新乡医学院(佑航标)