神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性初探

李志营 夏云 王占伟 杨伟科 焦继超

·实验研究·

神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性初探

李志营 夏云 王占伟 杨伟科 焦继超

目的探讨神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性。方法采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞作为观察组,非侧群细胞作为对照组,经3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)法对细胞生长曲线进行绘制,对细胞克隆形成能力、球囊形成能力、细胞成瘤能力以及细胞CD133的表达进行检测分析。结果神经胶质瘤C6细胞中侧群细胞所占比例为(4.32±1.41)%；侧群细胞生长速度较非侧群细胞快(P＜0.05)；在无血清条件下培养,侧群细胞具有形成球囊的特性,非侧群细胞无此特性；侧群细胞克隆形成率高于非侧群细胞(P＜0.05)；侧群细胞CD133表达水平高于非侧群细胞(P＜0.05)。结论在神经胶质瘤中存在有典型的侧群细胞,且侧群细胞中干细胞标志蛋白CD133呈现为高表达,可以在侧群细胞中分选富集神经胶质瘤干细胞样细胞,值得关注。

神经胶质瘤；干细胞样细胞；侧群细胞；干细胞标志蛋白

本次研究中,出于对神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性进行分析探讨,采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞进行了观察分析,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 所需试剂包括有链霉素、青霉素、Hoechst 33342、MTT、 胎牛血清、干细胞培养基、PRMI 1640培养基、FITC-CD133 抗体。

1.2 细胞系 取神经胶质瘤C6细胞,在37℃、 浓度为15%的二氧化碳条件下,在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素、PRMI 1640培养基中进行培养。

肿瘤的球囊培养采取干细胞无血清培养基,按照说明书进行操作,每3天加1次表皮细胞生长因子(EGF),剂量为20 ng/ml,碱性成纤维生长因子(b FGF)剂量为20 ng/ml,1×B27。

1.3 实验动物 选择BALB/c-nu裸鼠20只,鼠龄为5～6周,体重20～25 g,在没有特殊病原体的条件下进行饲养,分选侧群与非侧群细胞,分别取103、104、105、106四组,每组中包括有5只裸鼠,在裸鼠皮下接种,1个月后将裸鼠处死,并对成瘤率进行计算。

1.4 流式细胞仪分选侧群细胞 选择对数生长期的神经胶质瘤C6细胞,将其制备成单细胞悬液,并将细胞浓度调整至106/ml,而后加入Hoechst 33342,最终浓度为5mg/L,另外选取1ml细胞,加入维拉帕米,最终浓度为50mg/L,反应30min后,继续加入Hoechst 33342 作为对照。在37℃条件下,避光染色9min,染色过程中不断摇晃,将细胞摇匀,避免发生沉淀。而后经流式细胞仪进行侧群细胞分选［1,2］。

而后经MTT 法绘制细胞生长曲线,平板克隆法对细胞克隆形成能力进行检测,无血清悬浮培养对细胞的球囊形成能力进行观察,裸鼠移植瘤实验对细胞的成瘤能力进行检测,流式细胞仪对细胞CD133的表达水平进行检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 侧群细胞分选 神经胶质瘤C6细胞中侧群细胞所占比例为(4.32±1.41)%,而加入维拉帕米进行抑制后,侧群细胞所占比例在降至(0.05±0.02)%。

2.2 侧群细胞与非侧群细胞增殖速度 侧群细胞与非侧群细胞在2、4 d的生长速度比较,差异无统计学意义(P＞0.05),在6、8、10 d时,侧群细胞生长速度增加,较非侧群细胞快(P＜0.05)。见图1。

图1 侧群细胞与非侧群细胞增殖速度比较

2.3 侧群细胞与非侧群细胞球囊性生长以及克隆形成能力比较 在无血清条件下,侧群细胞存在明显的球囊形成特性,非侧群细胞无此特性。常规条件下培养,侧群细胞克隆形成率为(32.08±6.1)%,非侧群细胞的克隆形成率为(9.56±3.11)%,比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 侧群细胞与非侧群细胞CD133表达情况 侧群细胞CD133表达水平为(61.87±4.98)%,非侧群细胞的CD133表达水平为(1.02±0.76)%,比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

神经胶质瘤具有明显的浸润特征,中枢神经系统最为常见的一种恶性肿瘤,手术治疗无法彻底根除,即便是结合化疗、放疗,依旧存在肿瘤复发的可能性。曾有调查显示［3］,神经胶质瘤在脑肿瘤中所占比例为40.00%～60.00%,为神经系统最为常见的一种的肿瘤,近几年关于肿瘤治疗的技术不断改进,然而,对胶质瘤治疗的预后无明显改善。目前关于神经胶质瘤的研究不断深入,并获得较好的成效。

本次研究中,采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞,并对其进行了观察分析,细胞生长曲线进行绘制,对细胞克隆形成能力、球囊形成能力、细胞成瘤能力以及细胞CD133的表达进行检测,侧群细胞生长速度较非侧群细胞快(P＜0.05)；在无血清条件下培养,侧群细胞具有形成球囊的特性,非侧群细胞无此特性；侧群细胞克隆形成率高于非侧群细胞(P＜0.05)；侧群细胞CD133表达率高于非侧群细胞(P＜0.05)。

总之,在神经胶质瘤中存在有典型的侧群细胞,且侧群细胞中干细胞标志蛋白CD133呈现为高表达,可以在侧群细胞中分选富集神经胶质瘤干细胞样细胞,值得关注。

［1］陈宏颉,王守森,郑兆聪,等.RNAi 抑制 STAT3 对胶质瘤干细胞的生长抑制作用.中华神经外科杂志,2011,27(9):964-968.

［2］仇波,张东勇,陶钧,等.一种简化改良的脑胶质瘤干细胞培养方法.中国神经肿瘤杂志,2011,9(1):7-11.

［3］Chen HJ,Wang SS,Zheng ZC,et al.The inhibition studyof STAT3 siRNA on glioblastoma stem cells.Chinese Journalof Neurosurgery,2011,27(9):964-968.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.215

2015-12-29］

450000 河南省郑州市第七人民医院神经外科