淫羊藿苷对阿尔茨海默病细胞模型糖原合成酶激酶-3β表达的影响及机制

郑桃林　王　哲　刘　超　何　伟

(解放军第163医院神经内科，湖南　长沙　410003)



淫羊藿苷对阿尔茨海默病细胞模型糖原合成酶激酶-3β表达的影响及机制

郑桃林王哲1刘超何伟

(解放军第163医院神经内科，湖南长沙410003)

〔摘要〕目的研究淫羊藿苷(ICA)对阿尔茨海默病(AD)细胞模型糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)表达的影响及机制。方法以Aβ25~35孵育PC12细胞制备的AD细胞模型为研究对象，分为对照组、β-淀粉样蛋白(Aβ)组、ICA组、PI3K/Akt信号通路的经典抑制剂(LY)组、ICA+LY组，Western印迹法检测各组的蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表达。结果与对照组相比，Aβ组的p-Akt水平、p-GSK-3β水平明显下降(P<0.01)。与Aβ组相比，ICA组的p-Akt水平、p-GSK-3β水平明显增高(P<0.01)。与ICA组相比，ICA+ LY组p-Akt水平、p-GSK-3β水平明显下降(P<0.01)。结论ICA可能通过PI3K/Akt信号通路，上调p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达，发挥其保护作用。

〔关键词〕淫羊藿苷；阿尔茨海默病；糖原合成酶激酶3β；PI3K/Akt信号通路；蛋白激酶B(Akt)

1中南大学湘雅二医院中医科

第一作者：郑桃林(1977-)，男，主治医师，硕士，主要从事神经系统变性疾病的诊断及治疗研究。

β-淀粉样肽(Aβ)沉积以及tau蛋白磷酸化、老年斑(SP)形成、神经元纤维缠结(NETS)是阿尔茨海默病(AD)的病理学特征。糖原合成酶激酶(GSK)-3β是一种通过磷酸化作用的糖原合成的关键调节酶〔1,2〕。GSK-3β是为数不多的通过磷酸化而失活的蛋白激酶之一，磷酸化后其活性明显降低〔1〕，GSK-3β被认为参与了有淀粉样前体蛋白(APP)生成Aβ以及tau蛋白磷酸化过程。近来研究结果显示，GSK-3β能使tau蛋白多个位点磷酸化〔3〕。有动物研究结果显示：GSK-3β极有可能是AD脑中引起tau蛋白异常磷酸化的最关键的激酶之一〔4，5〕，抑制GSK-3β的活性，可能成为治疗AD的关键靶点。淫羊藿苷(ICA)是一种从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮类化合物。现代药理学研究ICA具有多方面的药理作用，如增加心脑血流量，延缓肾衰竭、调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗衰老等作用〔6〕。研究发现，在含有淫羊藿的中药复方脑灵汤的研究中，发现脑灵汤能抑制AD模型动物海马内GSK-3β的表达以及能改善其学习记忆功能〔7，8〕，但具体机制尚不清楚。本研究探讨ICA对Aβ引起的细胞存活率的影响及其部分机制。

1材料和方法

1.1材料PC12细胞购自中国医学科学院。ICA由中国食品药品鉴定研究院提供。Aβ25~35购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购自江苏碧云天生物科技研究所，胎牛血清购自Gibco公司，DMEM培养基购自Solarbio公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自美国Jackson公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学发光显色试剂盒均购自江苏碧云天生物科技研究所。

1.2方法

1.2.1PC12细胞的培养PC12细胞的培养液成分为90%高糖DMEM培养基(含青霉素及链霉素浓度均为100 U/ml)和10% 胎牛血清。二氧化碳培养箱中条件设置为37℃、5%CO2、饱和湿度。更换细胞培养液频率约为2~3 d/次，待细胞达70%~80%丰度时进行传代。药物干预及各项指标检测均取对数生长期细胞。

1.2.2Aβ25~35孵育PC12细胞制备AD细胞模型将1 mg纯度为97%的Aβ25~35溶于双蒸水中使其终浓度为1 μmol/ml。放置于-20℃冰箱备用。临用前至于37℃孵育1 w，使其凝聚。取对数生长期的PC12细胞调节其细胞浓度1×105/ml。取调节好浓度细胞培养液约2 ml接种于6孔板置于二氧化碳培养箱中培养24 h。24 h后加入Aβ继续培养24 h，然后收集细胞。

1.2.3实验分组对照组、Aβ组、ICA组、PI3K/Akt信号通路的经典抑制剂(LY)组、LY+ICA组。除对照组外，余下四组Aβ的浓度均为20 μmol/L；ICA组：先加ICA孵育1 h后再加Aβ，ICA浓度为20 μmol/L。LY组的LY294002浓度为50 μmol/L；LY+ICA组为先加LY294002浓度为50 μmol/L孵育1 h，再加ICA和Aβ使其浓度为20 μmol/L。LY294002为PI3K/Akt信号通路经典抑制剂。

1.2.4Western印迹方法将细胞收集于干净Ep管中，取蛋白裂解液按每1×106个细胞加200 μl蛋白裂解液。RIPA裂解液处理细胞，提取细胞总蛋白。Bradford 法测定各组样品蛋白质含量。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后用抗体孵育和显色，将胶片进行扫描，用图像分析软件IPP6.0对图像进行灰度分析。

1.2.5Western印迹条件说明电泳：浓缩胶50 V，分离胶100 V，电泳时间大概3 h左右；转膜：GSK3B，P-GSK3B 380 mA 1.5 h；封闭：5%脱脂牛奶(TBST稀释)，37 ℃ 2 h；一抗孵育：4℃孵育过夜(TBST稀释，Akt、p-Akt 1∶500，GSK-3β、p-GSK-3β 1∶500，β-actin 1∶2 000)；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；二抗孵育：室温1 h(TBST稀释，羊二抗 1∶5 000，兔二抗1∶4 000、鼠二抗1∶2 000)；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；显影：曝光时间，2~10 min。

2结果

2.1各组 Akt与p-Akt蛋白表达水平的比较与对照组相比，Aβ组p-Akt水平明显下降(P<0.01)；与Aβ组相比，ICA组p-Akt水平明显增高(P<0.01)；与ICA 组相比，ICA+LY组p-Akt水平明显下降(P<0.01)。见表1，图1。

表1　Western印迹法检测各组Akt磷酸化及GSK-3β

与Aβ组比较：1)P<0.01；与ICA组比较：2)P<0.01；与LY组比较：3)P<0.01

2.2各组GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达水平的比较与对照组相比，Aβ组的p-GSK-3β水平明显下降(P<0.01)；与Aβ组相比，ICA 组的p-GSK-3β水平增高(P<0.01)；与ICA组相比，ICA+LY组的p-GSK-3β水平明显下降(P<0.01)。见表1，图2。

图1　Western印迹检测的Akt、p-Akt蛋白表达

图2　Western印迹法检测的GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达

3讨论

AD发病机制目前仍不清楚，在众多关于AD发病机制的假说中，其中目前被普遍接受的是Aβ级联反应假说〔9〕。Aβ级联反应假说核心理论：在遗传或环境因素改变的情况下，脑内生成具有神经毒性作用的Aβ，Aβ通过一系列复杂的病理机制导致大脑神经元细胞变性、缺失，最终导致认知功能损害，即脑内异常沉积的Aβ是造成AD记忆认知损伤的始动因素，是诱发该病的中心环节。GSK-3β是一种通过磷酸化作用而抑制糖原合成酶的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是糖原合成的关键调节酶〔1,2〕，GSK-3β磷酸化后其活性明显降低〔1〕。GSK-3β的过度表达可以导致tau蛋白过度磷酸化〔10,11〕，而后者是引起AD的病因之一。因此理论上抑制GSK-3β的活性可能是防治AD的手段。因此本研究从中医药方面探讨AD发病机制，探求AD的有效防治措施。

PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，参与细胞的生长、增殖以及调节细胞分化。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PI3K通过PDK1磷酸化Akt使其活性增强，影响下游凋亡相关蛋白GSK-3β，发挥抗凋亡等作用〔12〕。PI3K/Akt信号通路可以调节葡萄糖转运、蛋白质的合成及分解〔13〕。研究发现，PI3K/Akt信号通路是Aβ引起的神经元凋亡的重要信号通路〔14〕。GSK-3β是PI3K/Akt通路下游分子，GSK-3β是为数不多的通过磷酸化而失活的蛋白激酶之一，磷酸化后其活性明显降低〔1〕，GSK-3β可以通过PI3K/Akt信号通路来进行负性调节〔15,16〕。张慧等〔17〕研究发现脑缺血预处理后能通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路增加AKt、GSK-3β的磷酸化水平来发挥抗细胞凋亡作用。亦有研究报道，Akt可以下调GSK-3β的活性〔18〕，其作用机制可能是Akt可以促进GSK-3β末端的丝氨酸磷酸化而使其灭活，阻止其对下游底物的促凋亡蛋白caspase-9以及caspase-3的磷酸化而起到抗凋亡作用。本实验提示Aβ可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制GSK-3β活性。

GSK-3β与AD的发病机制、病理以及治疗有着密切的联系。近来研究表明，GSK-3β可以使tau蛋白多个位点磷酸化〔19〕。NETS后导致神经突触可塑性下降，突触可塑性包括突触形态的可塑性及突触功能的可塑性。GSK-3β还可以通过磷酸化减少转录因子与DNA的结合，从而抑制其转录活性。转录因子在突触重塑、长期记忆的形成以及抗凋亡方面可以起到重要作用。因此，可以推测，增加GSK-3β的活性可以引起突触可塑性障碍〔20〕。GSK-3β的活性异常升高被认为可以诱导神经突触的可塑性损伤以及神经元的凋亡，这些均可能与AD的部分发病机制有关。因此，目前研究GSK-3β抑制剂治疗AD被认为很有前景的治疗靶点。李宁等〔21〕报道，GSK-3β已经成为治疗AD药物作用的一个重要潜在靶点。研究GSK-3β的调节机制以及在疾病状态下GSK-3β的调节如何被破坏，对于治疗AD至关重要，也是目前研究的热点。本实验提示Aβ 能明显下调PC12细胞中p-GSK-3β蛋白表达水平，ICA有拮抗Aβ引起的细胞存活率下降的作用，对AD细胞有神经保护作用。GSK-3β磷酸化水平增高可能是通过激活了上游的Akt活性而起到的作用。加入Akt抑制剂后，与LY组比较，ICA +LY组GSK-3β磷酸化水平明显增高，提示ICA可能通过多途径、多靶点、多层次发挥细胞保护作用，其机制有待进一步研究。

淫羊藿是祖国传统补益中药，具有温阳补肾、强筋健骨、祛风除湿等功效。ICA是一种从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮类化合物。现代药理学研究ICA具有多方面的药理作用，其生物学作用有多种，如增加心脑血流量，延缓肾衰竭、调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗衰老等作用〔6〕。前期研究报道：在选用含有淫羊藿的中药复方脑灵汤的研究中，脑灵汤能减轻AD模型大鼠海马CA3区神经元丢失现象，能对AD模型大鼠海马CA3区神经元具有保护作用，能恢复和改善其学习记忆功能〔7，8〕。聂晶等〔22〕研究发现ICA可以改善海马内注射Aβ25~35所致AD模型大鼠的学习记忆能力。但是否通过激活PI3K/Akt，上调其下游分子GSK-3β的表达，目前较少有相关报道。

文献报道抑制GSK-3β活性可能对防治AD有效〔23~25〕。在AD中，过度激活GSK-3β可以使tau蛋白过度磷酸化，也可以使Aβ产生增多〔25〕。因此，推测ICA可能通过PI3K/Akt信号通路抑制GSK-3β活性，发挥抗痴呆作用。

4参考文献

1Jiang H，Guo W，Liang X，etal.Both the establishment and maintenance of neuronal polarity require active mechanism：critical roles of GSK-3beta and its upstream reglulators 〔J〕.Cell，2005；120(1)：123-35.

2Macanas-Pirard P，Yaacob NS，Lee PC，etal.Glycogen synthase kinase-3 mediates acelaminophen-induced apoptosis in human hepatoma cells〔J〕.Pharmacol Exp Ther，2005；313(2)：780-9.

3Hanger DP，Betts JC，Loriny TL，etal.New phosphorylation sites identified in hyperphosphory lated tau(paired helical filament-tau)from Alzheimer′s disease brain using nanoelectrospry mass spectrometry〔J〕.J Neurochem，1998；71(6)：2465-76.

4Kornhuber J,Weller M.Psychotogenicity and N-methyl-D-aspartate receptor antagonism：implications for neuroprotective pharmacotherapy〔J〕.Biol Psychiatry，2007；41：135-44.

5Javitt DC.Glutamate as a therapeutic target in psychiatric disorders〔J〕.Mol Psychiatry，2004；9(11)：984-97,979.

6刘韶英，吴红金.淫羊藿苷药理作用的研究进展〔J〕.医学综述，2009；15(6)：909-12.

7宋文明.脑灵汤对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA3区域IGF-1和IGF-R表达的影响〔D〕.长沙：中南大学，2010.

8刘超群.脑灵汤对模型大鼠海马CA1区p-GSK-3β与p-GREB表达的影响〔D〕.长沙：中南大学，2006.

9Karran E，Mercken M，De Strooper B.The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer′s disease：an appraisal for the development of therapeutics〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2011；10(9)：698-712.

10Mohan ML，Jha BK，Gupta MK，etal.Phosphoinositide 3-kinase gamma inhibits cardiac GSK-3 independently of Akt〔J〕.Sci Signal，2013；6(259)：a4.

11Sonkusare SK，Kaul CL，Ramarao P.Dementia of Alzheimer′s disease and other neurodegenerative disorders-memantine，a new hope〔J〕.Pharmacol Res，2005；51：1-17.

12Bassili M，Birman E，Schor NF，etal.Differential roles of Trk and p75 neurotrophin receptors in tumorigenesis and chemoresistance ex vivo and in vivo〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2010；65(6)：1047-56.

13Kim D，Chung J.AKT：versatile mediator of cell survival and beyond〔J〕.Bioehem Mol Biol，2011；135：106-15.

14Cross TG，Scheel-Toellner D，Henriquez NV，etal.Serine/Threonie protein kinases and apoptosis〔J〕.Exp Cell Res，2000；256(1)：34-41.

15Grimes CA，Jope RS.The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3β in cellular signaling〔J〕.Prog Neurobiol，2011；65：391-426.

16刘晓燕，张志珺.Tau 蛋白在阿尔茨海默病中的研究进展〔J〕.中华脑血管病杂志，2011；5(5)：411-4.

17张慧，姜咏梅，尹琳.PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在脑缺血预处理中的作用及对海马细胞凋亡的影响〔J〕.华中科技大学学报：医学版，2011；40(4)：408-28.

18Kaytor MD，Orr HT.The GSK3 beta signaling cascade and neurodegenerative disease〔J〕.Curr Opin Neurobiol，2002；12(3)：275-8.

19Nemoto T，Kanai T，Yanagita T，etal.Regulation of Akt mRNA and protein levels by glycogen synthase kinase-3β in adrenal chromaffincells：effects of LiCl and SB216763 〔J〕.Eur J Pharmacol，2008；586：82-9.

20Jo J，Whitcomb DJ，Olsen KM，etal.Abeta(1-42)inhibition of LTP is mediated by a signaling pathway involing caspase-3，Akt and GSK-3beta〔J〕.Nat Neurosci,2001；14(5)：545-7.

21李宁，刘耕陶.糖原合成激酶3：一个治疗阿尔茨海默病潜在的药物新靶点〔J〕.中国药理学通报，2007；23(12)：1544-8.

22聂晶，罗勇，黄言南，等.淫羊藿苷对淀粉样β蛋白片段25-35所致大鼠学习记忆障碍的改善作用〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2008；22(1)：33-7.

23Garcia I，Fall Y，Gomez G.Using topological indices to predict anti-Alzheimer and parasitic GSK-3 inhibitors multi-target QSAR in silico screening〔J〕.Molecules，2010；15(8)：5408-22.

24Martinez A，Castro A，Dorronsoro I，etal.Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3)inhibitors as new promising drugs for diabetes，neurodegeneration，cancer，and inflammation〔J〕.Med Res Rev，2012；22：373-84.

25Ayton S，Lei P.The-Aβ-induced NAFT apoptotic pathway is also activated by GSK-3 inhibition：implication for Alzheimer therapeutics〔J〕.J Neurosci，2012；32(28)：9454-6.

〔2014-08-11修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：湖南省中医药科研项目重点课题(No.M201225)

〔中图分类号〕R741.02

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0800-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.013