棘孢木霉对黄花蒿叶的光合特性和产量影响

杨兴堂， 吕曼曼， 刘志华， 朱国栋， 王 慧， 马德志， 张荣沭*

(1.东北林业大学 园林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 3.齐齐哈尔医学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

棘孢木霉对黄花蒿叶的光合特性和产量影响

杨兴堂1， 吕曼曼1， 刘志华2， 朱国栋1， 王 慧1， 马德志3， 张荣沭1*

(1.东北林业大学 园林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 3.齐齐哈尔医学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

为了对黄花蒿的增产和促进木霉免疫诱导剂类生物肥料在植物生长中的应用提供理论依据，在大田条件下进行根施1×105cfu/mL(T1)、1×106cfu/mL(T2)和1×107cfu/mL(T3)3个水平的棘孢木霉ACCC30536分生孢子对黄花蒿叶的光合特性和产量的影响试验。结果表明：T3水平(200 mL/株)的木霉菌对黄花蒿的诱导效果最佳；根施木霉孢子量与青蒿叶片净光合速率(Pn)呈正相关，光合“午休”现象有一定程度的减缓；T3处理黄花蒿的光合-光响应曲线参数最大净光合速率、表观量子效率、暗呼吸速率及光饱和点、光补偿点均高于CK和其他处理。并且，木霉菌诱导黄花蒿60 d后T3组黄花蒿叶的产量较CK提高最大。说明，棘孢木霉ACCC30536能够改善黄花蒿的光合能力，促进干物质的积累，从而提高其叶的产量。

棘孢木霉； 黄花蒿； 光合特性； 光响应； 叶产量

国际上应用非常普遍的木霉(Trichoderma)生防真菌能定殖在植物根际，具有增产、防治病害和改良土壤的作用[1-2]。木霉菌能通过提高植株的光合作用及增加土壤养分溶解促进植物生长，提高其产量。同时，发育健壮的植物抗病能力提升[3-4]。植物的生长是通过光合作用固定有机物积累干物质来实现的，所以提高植物的光合作用有助于其生物量的积累。黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)为菊科一年生草本植物，是我国的传统中药，具清热凉血、退虚热，解暑的功效，其提取物青蒿素有显著的抗疟、解热镇痛作用，目前已替代了传统的奎宁类抗疟药物，被广泛应用于临床治疗各型疟疾[5-6]。迄今为止，青蒿素的生产仍主要依靠从人工种植的黄花蒿叶中提取[7]。随着青蒿素市场需求量的不断增大，如何提高栽培黄花蒿的产量已成为人们研究的热点。棘孢木霉ACCC30536能显著改善山新杨的光合特性[8]。但采用木霉菌诱导黄花蒿提高其产量的研究报道极少。因此，笔者采用棘孢木霉ACCC30536分生孢子根施黄花蒿，分析木霉菌对黄花蒿叶的光合特性和产量的影响，为木霉免疫诱导剂类生物肥料在促进黄花蒿生长，提高其叶产量的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黄花蒿种子采自重庆酉阳，按张荣沭[9]的方法进行温室纸筒育苗。棘孢木霉ACCC30536(T.asperellumACCC30536)菌株由东北林业大学林学院森保学科提供。

1.2 试验设计

木霉分生孢子培养采用PDA固体培养基(主要成分为马铃薯、葡萄糖和琼脂粉，pH自然)，将活化的木霉分生孢子在无菌条件下接种到培养皿中，在28℃条件下培养6 d获得大量分生孢子。用自来水配制成高浓度的孢子悬液，显微镜下计数，测得其浓度，用自来水将其稀释为1×105cfu/mL、1×106cfu/mL和1×107cfu/mL 3个水平的木霉孢子悬液。

2014年5月10日黄花蒿幼苗从温室移栽至哈尔滨市郊大田，株间距30 cm，行间距60 cm。小区面积18 m2(6 m×3 m)。7月10日将1×105cfu/mL(T1)、1×106cfu/mL(T2)和1×107cfu/mL(T3)的木霉孢子悬液根施黄花蒿，200 mL/株，对照(CK)施用等体积的自来水，3次重复。试验期间管理措施相同，黄花蒿生长期间保持土壤水分充足，定期除草、松土。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 光合作用日变化的测定 8月中旬，选择晴朗无风的天气，各试验组中选3株长势一致的黄花蒿，在其近顶端选取3片健壮的成熟叶片测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Cond)和胞间CO2浓度(Ci)的日变化。测定仪器为便携式光合作用分析仪(Li-6400XT，美国LI-COR公司)，采用开放式气路，CO2浓度约为350 μL/L左右，自然光照，8:30-16:30每隔2 h测定1次。

PLL电路是一个相位负反馈环路，由鉴相器、环路滤波器和压控振荡器(VCO)组成，它将输入信号与VCO输出信号的相位进行比较，控制两个信号使其保持同相位。若在PLL输入信号中加上由晶振等产生稳定的频率信号，在VCO输出与鉴相器输入之间接入分频器，通过切换分频器的频率，便得到VCO的输出与输入频率同样精度的分频信号[7]。这就是PLL合成频率源的工作原理，如图1所示。

1.3.2 光响应曲线的测定和参数分析 8月中旬选择3个晴天，在9:00-12:00期间，随机选取各试验组的黄花蒿近顶部无病虫害、朝向一致的健壮成熟叶片，用内置6400-02 LED红蓝光源和6400-01CO2注入系统的Li-6400XT便携式光合测量系统，进行连体叶片光合速率测量。光合有效辐射设定的梯度为12个：2 000 μmol/(m2·s)，1 800 μmol/(m2·s)，1 500 μmol/(m2·s)，1 200 μmol/(m2·s)，1 000 μmol/(m2·s)，800 μmol/(m2·s)，600 μmol/(m2·s)，400 μmol/(m2·s)，200 μmol/(m2·s)，100 μmol/(m2·s)，50 μmol/(m2·s)，20 μmol/(m2·s)，以不照射为对照。CO2浓度为350 μL/L，叶面温度由Li-6400温度控制器控制在(30±1)℃。采用非直角双曲线模型[10-11]按照公式(1)利用SPSS统计软件对测定数据结果进行拟合，从而计算最大净光合速率(Pn)、表观量子效率(AQY)和暗呼吸速率(Rd)等光合-光响应曲线参数。光饱和点(LSP)和光补偿点(LCP)的计算方法是将0～200 μmol/(m2·s)低光强下的光响应曲线进行线性回归分析。直线与X轴(PAR)的交点就是LCP；该直线与Y=Pnmax直线相交，交点所对应X轴的数值即为LSP。

式中，Pn为净光合速率，E为光照强度(PAR)，Pnmax为最大净光合速率，Q为表观量子效率(AQY)，k为曲角，Rd为暗呼吸速率。

1.3.3 黄花蒿叶产量的测定 木霉诱导60 d后，测量黄花蒿叶的产量。将各试验组黄花蒿的叶片从其枝条上分离称量鲜重；称重后，将叶片按照文献[12]的方法烘干，再分别称量干重。

1.4 数据分析

利用Microsoft Office Excel 2007处理数据和绘制图表。用SPSS18.0和Minitab 16.0软件包进行统计分析及在P=0.05下比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 黄花蒿光合生理因子的日变化

2.1.1 净光合速率(Pn) 3个水平木霉菌诱导后黄花蒿与CK的净光合速率变化趋势基本一致，均呈双峰型曲线，峰值分别出现在10:30和14:30，说明黄花蒿存在午休现象(图1)。并且Pn在14:30的峰值基本上大于10:30的峰值。T3处理的光合速率在8:30-16:30明显高于其他处理和CK，且在12:30处的T3>T2>T1>CK，说明,根施木霉菌既能提高黄花蒿的光合作用又能缓解光合午休现象(图1)，提升了杨树苗对光的生态适应能力。并且木霉菌处理提高黄花蒿光合能力与其施用的木霉分生孢子的剂量有关，最佳施用剂量为1×107cfu/mL(200 mL/株)。

2.1.2 气孔导度(Cond) 从图1看出，3个水平木霉菌诱导后黄花蒿与CK的气孔导度日变化规律基本一致，并且在不同程度上增强了黄花蒿的气孔导度。其中，T3和T2处理对黄花蒿气孔导度的影响较大。说明，木霉菌对黄花蒿气孔导度的影响也与施用的木霉剂量相关。在12:30由于气温升高，蒸腾速率增大，木霉处理组的气孔导度增量较其他时间点减小。因为植物是通过改变气孔数目和开闭程度来调节叶片的蒸腾速率和水势，并且光合作用和干物质积累所需要的二氧化碳也是通过气孔而获得，所以气孔在调控水分丢失和光合作用之间总是处于一种折中状态。说明根施适量的木霉菌能够使黄花蒿提高自身与环境对水分和CO2的交换能力，有利于黄花蒿调整水分以适应环境温度和摄入CO2，提高其对干物质的积累。

图1 不同处理黄花蒿叶光合生理因子的日变化

2.1.3 胞间CO2浓度(Ci) 从图1表明，3个水平木霉菌诱后黄花蒿和CK的胞间CO2浓度日变化规律基本一致。检测初期的胞间CO2浓度较高，之后一直下降，到12:30降到最低点，再一直升高。木霉菌处理组黄花蒿的Ci均比CK高，并且T3和T2水平的木霉诱导效果相近，在10:30-14:30Ci变化不大。说明，木霉菌能够提高胞间CO2浓度，有利于黄花蒿光合作用的进行，增加干物质的积累，从而提高叶的产量。

2.2 黄花蒿的光响应曲线参数

根据图2、图3和表的结果：

1) 木霉菌可以提高黄花蒿叶片最大净光合速率，并且黄花蒿叶片最大净光合速率提高与施用的木霉分生孢子量的大小呈正相关，即最大净光合速率T3>T2> T1>CK，差异显著(P<0.05)。最大净光合速率较高有利于干物质的积累，能为提高植物产量奠定良好的生理基础。

图2 黄花蒿叶的光合速率的光响应

图3 低光强下黄花蒿的Pn-PAR拟合直线[PAR﹤200/μmol(m2·s)]

Fig.3 Pn-PAR Fitted lines ofA.annualeaf under low light intensity

2) 表观量子效率(AQY)是光合作用中光能转化效率的指标之一，是净光合速率与相应光量子通量密度的比值。T1和T2水平木霉菌诱导后黄花蒿叶片的AQY值差异不大，但T3处理显著高于其他试验组，为0.055 μmol/mol。说明，适量的木霉孢子诱导可以提高黄花蒿对光能的转化效率。

3) 暗呼吸速率(Rd)反映植物在黑暗条件下的

呼吸速率。采用不同水平木霉分生孢子处理的黄花蒿，其叶片的暗呼吸速率随着施用木霉分生孢子水平的增加而增大。然而，暗呼吸速率小才有利于植物在低Pn条件下保持碳平衡。

表 黄花蒿叶片的光合光响应曲线模拟参数

注：每列中不相同字母表示在P< 0.05水平上显著性差异。

Note: Different letters in the same column indicate significance of difference atP< 0.05 level.

4) 光饱和点(LSP)是植物利用强光能力大小的指标。T2和T3的光饱和点(LSP)分别是CK的1.07倍和1.05倍，均显著大于CK和T1(P<0.05)。说明，采用T2、T3水平的木霉分生孢子诱导黄花蒿，提高了植物对光的生态适应能力。

5) 光补偿点(LCP)是植物利用弱光能力大小的重要指标，该值越小表明利用弱光的能力越强。具有高LSP与低LCP的植物，对光的生态适应能力强，受到强光刺激时不易发生抑制。虽然本试验中黄花蒿的LCP值表现出与Rd值一致的变化规律，但施用不同水平木霉诱导后，T2和T3组黄花蒿LSP与LCP的差值相近，分别为1 368.09和1 346.62；T1和CK组黄花蒿LSP与LCP的差值相近，分别为1 267.13和1 286.05。说明，T2和T3木霉分生孢子诱导黄花蒿，能显著提高黄花蒿对光的生态适应能力。

2.3 黄花蒿叶的产量

试验结果表明，不同浓度的棘孢木霉分生孢子诱导黄花蒿60 d后，T1、T2、T3和对照叶片的干重分别为(68.34±8.25)g/株、(73.96±8.52)g/株、(83.56±9.81)g/株和(66.38±8.92)g/株。说明，随着木霉分生孢子浓度的增加，黄花蒿生物量产量也呈上升趋势。T3和T2处理单株黄花蒿叶的平均干重与CK和T1相比存在显著差异(P<0.05)，分别是CK的1.26和1.11倍。表明，施用适量棘孢木霉分生孢子具有促进黄花蒿的生长的作用。

3 结论与讨论

1) 黄花蒿除了具有抗疟疾、杀虫、抗癌、清热解毒等药理作用外，还能用于调节植物生长。黄花蒿的有效药用成分为叶组织，因此，提高叶组织的产量是栽培黄花蒿获取大的经济效益追求的目标之一。在以往对影响黄花蒿产量因素的研究中，多以施用化肥改变土壤中氮磷钾等大量元素含量、锌锰硼等微量元素含量[13-14]，以及采取不同的栽培措施[15]、在不同生长时期改变土壤水份[16]等方法来建立增产的最佳管理办法。而通过施用木霉菌来提高黄花蒿有效生物量的研究极少。木霉菌(Trichoderma)是一种国际上农林业生产实践中应用越来越广泛的生防因子和生物肥料，不仅对植物病原菌具有竞争作用、重寄生作用及抗菌作用，而且还有溶解作用使植物提高对营养物质的吸收和促进植物生长。本试验采用不同水平的木霉分生孢子溶液根施黄花蒿，能使其叶产量提高1.26倍。说明木霉能显著提高黄花蒿叶的产量。研究发现，植物益生菌能改善土壤环境[2]，然而，施入土壤的有益微生物也会影响其原有微生物环境的生态平衡。大量施入土壤中的木霉菌，会打破土壤原有的菌群互生的平衡关系，改变植物赖以生存土壤的微生态环境。因此，木霉的施用剂量对土壤的改良效果不同。本研究发现，施用浓度为1×107cfu/mL (200 mL/株)的木霉分生孢子，能获得最高的黄花蒿叶产量。

2) 植物是通过光合作用获取能量来合成有机物，可见高效的光合作用对植物积累干物质、增加产量至关重要。研究发现，哈茨木霉能显著提高番茄植株叶片的光合作用[17]。陆宁海[18]等施用哈茨木霉制剂通过增加叶片的叶绿素含量来提高光合作用能力，使小麦和玉米幼苗生长发育增快。王慧[8]等用5×103cfu/cm3土的棘孢木霉分生孢子诱导山新杨，显著提高了其光合-光响应能力。说明木霉菌不仅对草本植物而且对木本植物的光合作用均具有积极的影响。本实验结果表明，施用3个水平木霉菌的黄花蒿最大净光合速率明显高于对照，并且对黄花蒿光合作用的影响与施入木霉的剂量相关。T3处理的最大净光合速率，光饱和点和表观初始量子效率均有显著提高。并且T3和T2的LSP与LCP的差值显著大于T1和Con组，改善了黄花蒿对光的生态适应能力，说明根施木霉后的黄花蒿提高了对光能的利用，有利于其产量的增加。

3) 随着医药市场对黄花蒿的药效成分青蒿素需求量的增加，黄花蒿的需求量也随之提高[19]。本试验结果表明：施加棘孢木霉ACCC30536能显著影响黄花蒿光合特性、提高其药用生物量产量，在大面积种植的前提下，施用木霉菌肥增加的收入将非常可观。由于青蒿素产量是由黄花蒿生物量产量和青蒿素含量所共同决定的，提高黄花蒿生物量产量只是增加青蒿素产量的一种途径，木霉菌对黄花蒿中青蒿素含量的影响也极为重要，相关内容还需作进一步研究。

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(责任编辑： 聂克艳)

Effects ofTrichodermaasperellumon Leaf Photosynthetic Characteristics and Yield ofArtemisiaannua

YANG Xingtang1, LU Manman1, LIU Zhihua2, ZHU Guodong1,WANG Hui1, MA Dezhi3, ZHANG Rongshu1*

(1.CollegeofLandscapeArchitecture,NortheastForestryUniversity,Harbin,Heilongjiang150040; 2.SchoolofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin,Heilongjiang150040; 3.QiqiharMedicalCollege,Qiqihar,Heilongjiang161006,China)

The photosynthetic characteristics and leaf yield ofArtemisiaannuarespectively applying with 1 105cfu/mL(T1), 1×106cfu/mL(T2)and 1×107cfu/mL(T3)T.asperellumACCC30536 conidium by root application in field were studied to provide the theoretical basis for increasingArtemisiaannuayield and promoting application ofTrichodermaas an immune-inducing biofertilizer in plant growth. Results: The inductive effect of T3 treatment onArtemisiaannuais the best among three treatments. The application amount ofTrichodermaasperellumspores is positively related toPnofArtemisiaannualeaves. ApplyingTrichodermaasperellumcan retard the photosynthetic “noon break” phenomenon to some extent. The maximum net photosynthetic rate, apparent quantum yield, dark respiratory, light saturation point and light compensation point ofArtemisiaannuatreated with 1 107cfu/mL(T3)T.asperellumACCC30536 conidium all are higher than CK, T1 and T2 treatment. TheArtemisiaannualeaf yield of T3 treatment increases significantly compared with CK after 60 d. In conclusion, applyingT.asperellumACCC30536 can improve the photosynthetic capacity ofArtemisiaannuaand promote dry matter accumulation, which results in yield increase ofArtemisiaannualeaf.

Trichodermaasperellum;Artemisiaannua; photosynthesis; photoresponse; leaf yield

2015-06-02； 2016-01-07修回

国家自然科学基金资助项目“木霉诱导下杨树ARF转录因子对其生长及抗病的分子调控机制”(31370642)；国家自然科学基金资助项目“棘孢木霉的刺激植物响应蛋白Epl1诱导杨树系统抗病性机制”(31170601)；黑龙江省自然科学基金资助项目“木霉菌促进山新杨生长的Auxin信号转导机制”(C201216)

杨兴堂(1990-)，男，在读硕士，研究方向：园林植物种质资源。E-mail：1270314027@qq.com

*通讯作者：张荣沭(1965-)，女，副教授，硕士生导师，从事园林植物病害生物防治研究。E-mail：zrs6504@sina.com

1001-3601(2016)01-0035-0132-05

S567.21+9

A