朱顶红赤斑病病原菌鉴定

冉双飞， 陈 云， 姜于兰*， 刘 洪

(1.贵州大学， 农学院植物保护系， 贵州， 贵阳550025； 2.沿河自治县泉坝乡人民政府， 贵州 沿河 565313)

朱顶红赤斑病病原菌鉴定

冉双飞1， 陈 云1， 姜于兰1*， 刘 洪2

(1.贵州大学， 农学院植物保护系， 贵州， 贵阳550025； 2.沿河自治县泉坝乡人民政府， 贵州 沿河 565313)

为了对防治朱顶红赤斑病提供理论基础，结合形态学与分子生物学的方法，对观赏性朱顶红赤斑病进行病原菌鉴定。结果表明：叶片接种赤斑病菌2 d后开始发病，5 d后叶片上产生赤色小点，后逐渐扩大为圆形或椭圆形病斑，发病症状与田间症状相似，从发病叶片上分离得到的病原菌分生抱子形态及大小均与初种菌株相同；病原菌ITS测序所得序列与NCBI对比，该病原菌菌株与ColletotrichumgloeosporioidesstrainHT31菌株的同源性为99%；LSU测序所得序列与NCBI对比，该病原菌菌株与ColletotrichumgloeosporioidesstrainCZ043C菌株的同源性为99%。结论：引起朱顶红赤斑病的病原菌为炭疽菌属胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

朱顶红赤斑病； 病原菌鉴定

朱顶红是极具观赏和收藏价值的一种花卉，以稀奇高雅而倍受人们的青睐。近年来快速发展的朱顶红产业已成为中国花卉业的重要组成部分，但由于病害的严重发生大大制约了朱顶红产业的发展[1-3]。因此，了解朱顶红病害的致病源对朱顶红病害的防治有着极其重要的意义。危害朱顶红的病害主要有叶枯病、红斑病、病毒病、叶斑病、紫斑病、花叶病、线虫病、细菌性软腐病、镰刀菌枯萎病等[4-5]。病原菌的鉴定方面前人多以形态学作为主要研究手段对病害进行描述，存在很大的局限性。因此，笔者等结合形态学与分子生物学的方法，对朱顶红赤斑病的病原菌进行鉴定，为防治朱顶红赤斑病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌的采集、分离与回接

从盆栽的朱顶红上采集病害标本，带回实验室进行处理与保存。

病原物的分离采用组织分离法[6]：于病健交界处剪下0.5 cm×0.5 cm的叶片若干，经75%酒精消毒2～3 s，0.1%升汞消毒20～30 s，再经无菌水漂洗3次，接于PDA平板培养基上，25℃培养2 d后纯化。将纯化后的菌株保存于装有灭菌水的小管中，于4℃冰箱保存。

回接菌株按柯赫氏法则：摘取健康的朱顶红叶片，用75%的酒精对其进行表面消毒，无菌水冲洗2～3次，用灭菌的接种针将叶片正面刺伤。用灭菌的打孔器沿培养5 d后的菌株周缘取直径为0.5 cm的菌饼，菌丝面朝下接于叶片刺伤处，以刺伤不接菌饼的叶片作对照。将处理后的叶片置于灭菌的培养皿中，25℃光照培养箱中培养20 d，每天补充水分并观察叶片发病情况。

1.2 病原的鉴定

病原的鉴定结合病原的形态学鉴定和分子鉴定进行。

形态学鉴定：将病原物接种于新鲜PDA平板上，置于25℃培养箱中光照培养20 d左右，其间观察菌落生长情况，待产孢后挑取产孢结构制片，于显微镜下观察产孢器和孢子形态特征，测量产孢结构和孢子大小。

分子鉴定：采用Biomiga公司生产的DNA提取试剂盒提取DNA。采用多聚核苷酸链式反应(PCR)的方法扩增核糖体RNA内转录间隔区(ITS)基因，ITS基因扩增使用的引物为ITS4和ITS5，由北京诺赛生物技术有限公司合成。参照Damm等[7]的研究，另选用引物LSU扩增DNA序列。所用引物由北京诺赛生物技术有限公司合成，扩增反应均在25 μL体系中进行，该体系含有如下成分：9.5 μL ddH2O，12.5 μL mix试剂，Primer-1和Primer-2各1 μL，DNA模板1 μL。PCR产物送北京诺赛公司测序。将得到的基因序列与NCBI基因库中的序列进行对比，确定菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 病害症状及病原回接症状

朱顶红赤斑病病菌混在病残体中的菌核于土表越冬或越夏，主要侵害叶、茎及花部，叶片染病初期生赤色小点，后逐渐扩大为圆形或椭圆形斑，中央赤褐色略凹陷， 浓褐色稍隆起，病健部交界明显，病斑布于叶两面(图1a)；茎或叶柄染病开始也现赤色小点，后扩展为边缘深赤褐色条斑。叶片接种赤斑病菌2 d后开始发病，发病症状与田间症状相似，回接5 d后，叶片上产生赤色小点，后逐渐扩大为圆形或椭圆形斑(图1b)。从发病叶片上可重新分离得到该病原菌,重新分离得到的病原菌的培养性状，分生抱子形态及大小均与当初种菌株相同。确定该菌株即为病原。

图1 朱顶红赤斑病叶片自然发病症状(a)和 病原菌回接症状(b)

Fig.1 Symptoms of natural infection(a) and artificial infection(b) of amaryllis red spot disease

2.2 病原菌特征

炭疽菌属(Colletotrichumgloeosporioides)病原经PDA培养后，菌落呈圆形，初生菌丝为白色绒毛状，随时间推移逐渐变为不规则圆形菌落，菌丝底部逐渐变为淡黄色，并产生黑色的小点(图2a、b)。1周后产生分生孢子，分生抱子梗短线状,单根无色，顶生1个分生孢子，分生抱子圆筒形或长椭圆形，两端圆或一端略粗，直或稍弯，单孢无色，大小为3.7～6.2 μm×1.2～2.2 μm(图2c)。

图2 炭疽属病原菌正面(a)、背面(b)及病原菌孢子(c)

2.3 病原菌测序结果

炭疽菌属的ITS测序结果：

A，将所得序列与NCBI进行对比，该病原菌菌株与Colletotrichumgloeosporioidesstrain HT31菌株的同源性为99%，其登录号为FJ455525。

炭疽菌属的LSU测序结果：

AG，将所得序列与NCBI进行对比，该病原菌菌株与Colletotrichumgloeosporioidesstrain CZ043C菌株的同源性为99%，其登录号为FJ755268。

3 结论与讨论

朱顶红赤斑病是花卉的病害之一，由于各种病害的制约，全球的花卉市场始终难以得到更大的发展。在已有报告中，花卉上病原菌的鉴定仅限于形态学，鉴定结果可能导致一定程度的误差。目前国际上利用形态学与分子生物学相结合鉴定病原菌已成为一种趋势[8]。综合病原形态特征、ITS序列和LSU序列比对结果，将引起朱顶红赤斑病的病原菌为炭疽属胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。出现鉴定结果不一致的原因主要有两方面：一是在此之前病原菌仅依据形态学进行鉴定不准确；二是该病害受各种因素的影响，病原菌发生了变异。而解决问题的方法可以通过多年的调查来判断该病害是否属于偶发病害，并结合形态学和分子生物学的手段对我国朱顶红赤斑病的病原进行重新鉴定。

[1] 郭丽霞,莫 饶.朱顶红育种研究现状及进展[J].广西农业科学,2007(3):303-309.

[2] 李振坚,王 雁,彭镇华,等.朱顶红在全球花卉贸易中的地位及发展动态[J].中国农学通报,2008(5):154-159.

[3] 于 玲.花卉病害诊断专家系统[D].武汉：华中农业大学,2006.

[4] 王 贤,熊 敏,卫尊征,等.朱顶红研究综述[J].农业科技与信息(现代园林),2014(8):49-54.

[5] 陈少萍.朱顶红栽培与病虫害防治[J].中国花卉园艺,2014(16):32-34.

[6] 谭舒心.蜘蛛兰褐斑病及其病原菌鉴定与病害的药剂控制试验[D].重庆：西南大学,2009.

[7] Damm U，Cannon P F，Woudenberg J H C，et al. The Colletotrichum boninense species complex [J].Studies in Mycology,2012,73:1-36.

[8] 贲海燕.我国北方主要花卉新病害及病原鉴定[D].哈尔滨：东北农业大学,2008.

(责任编辑： 聂克艳)

Pathogenic Identification of Amaryllis Red Spot Disease

RAN shuangfei1， CHEN yun1， JIANG yulan1*， LIU hong2

(1.DepartmentofPlantPathology,AgricultureCollege,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.People’sGovernmentofQuanbaTown,Yanhe,Guizhou565313,China)

Toprovide theoretical basis for prevention and control of amaryllis red spot disease, the methods of morphology and molecular biology were employed to identify the pathogenic bacteria. Results: After 2ndday of inoculation pathogen produced red leaf spot which changed into red spots after 5thday of inoculation and they regularly expanded to oval spots, these symptoms were similar to that in the fileds. The obtained pathogen conidia had shape and size similar to previous pathogen conidia; the obtained ITS sequence of concern pathogen had 99% similarity with the sequence obtained from NCBI and it was identical toColletotrichumgloeosporioidesstrain HT31.LSU sequence was also compared with NCBI sequences, and the pathogen strains were related toC.gloeosporioidesstrain CZ043C with 99% similarity. Conclusion: Amaryllis red spot disease was caused byC.gloeosporioides.

amaryllis red spot disease; pathogenic identification

2015-03-19； 2015-12-24修回

国家自然科学基金(31560489)

冉双飞(1990-)，男，在读硕士，研究方向：真菌分类及病害综合防治。E-mail：520ranshuangfei@sina.com

*通讯作者：姜于兰(1974-)，女，教授，博士，从事植物病害综合防治，暗色丝孢真菌分类、分子系统学及真菌资源利用研究。 E-mail：yljchsd@163.com

1001-3601(2016)01-0020-0072-03

S436.8； S682.2+5

A