工厂化生产香肠肠衣腐烂黑斑中嗜盐细菌的分离鉴定及其特征特性

牟丽丽， 涂云华， Syren de Hoog，刘涛华， 吕 倩， 王颜颜， 陈 燕， 康颖倩*

(1.贵州医科大学 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550004； 2.CBS荷兰皇家科学院 真菌生物多样性中心， 荷兰 乌得勒支 85167)

工厂化生产香肠肠衣腐烂黑斑中嗜盐细菌的分离鉴定及其特征特性

牟丽丽1， 涂云华1， Syren de Hoog2，刘涛华1， 吕 倩1， 王颜颜1， 陈 燕1， 康颖倩1*

(1.贵州医科大学 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550004； 2.CBS荷兰皇家科学院 真菌生物多样性中心， 荷兰 乌得勒支 85167)

为工厂化生产的相关食品及农产品储存过程中微生物的鉴定及抑菌对策提供理论依据，采用高盐察氏液体培养基(Czapek Dox Broth)梯度盐浓度培养法，CDA(Czapek Dox Agar)及TSA(Trypticase Soy Agar)固体培养基进行分离纯化，16S rRNA基因测序，邻接法构建16S rRNA序列的系统发育树等方法，对工厂生产香肠肠衣腐烂黑斑中嗜盐细菌进行分离鉴定，研究其特征特性。结果表明：25%～30%盐浓度固体培养基中分离到3株嗜盐细菌(Gyfl1，Gyfl2，Gyfl3)，经分子学分析鉴定Gyfl1为Halomonasvariabilis,Gyfl2为Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3为Chromohalobactercanadensis；经药敏试验，庆大霉素、卡那霉素、利福平、红霉素和新霉素等常见抗生素均能抑制嗜盐菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明显。

嗜盐细菌； 香肠肠衣； 系统发育树； 抗生素敏感

香肠作为一种历史悠久的农副食品，因其香味浓郁、口感独特和耐储藏等优点，深受世界各地人们的青睐。香肠是由拉丁文“Salsus”衍生出来的，意为带有咸味的食物。将肉切碎，加入食盐、糖和香辛料，灌进肠衣内进行干燥制成的肉制品，可在常温下保存较长时间[1]。食盐在香肠等传统腌腊肉制品中有呈味、延长保质期及着色等主要作用，如通过高离子浓度来降低水分活度和抑制细菌的滋生，延长其产品的保质期。在香肠生产加工管理过程中已建立HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point)体系，通过对食品加工过程的关键环节实施有效监控，将食品安全卫生危害消除或降低至安全水平[2-4]，然而一些技术问题的出现并不能完全防止香肠腐败。据报道[5]，从香肠上分离出的嗜盐细菌(Halobacteriumcutirubrum)能导致香肠味道的改变，严重地影响其产品的质量，对企业造成无法挽回的损失。近年来，高盐环境中分离的嗜盐菌新种不断被发现[6-8]，嗜盐菌的生理及遗传特性具有丰富的研究价值，而盐渍类食品来源的嗜盐菌的研究报道较少。为此，笔者从工厂化生产的成品香肠中选取腐烂香肠肠衣进行微生物的分离鉴定，并对其特征特性进行了研究，获得3株具有耐盐性的嗜盐菌株，初步推断为引起香肠腐烂的腐败菌，以期为生产上相关食品及农产品储存过程中微生物的鉴定及抑菌对策提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 腐烂香肠样本 由荷兰CBS真菌生物多样性研究中心(CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre)在荷兰某香肠加工厂采集，包括腐烂的猪肠衣香肠及腐烂的羊肠衣香肠。

1.1.2 试剂 CDB(Czapek Dox Broth)液体培养基、CDA(Czapek Dox Agar)固体培养基、TSA(Trypticase Soy Agar)固体培养基、革兰氏染色试剂盒、MH(Mueller-Hinton)肉汤培养基及药敏纸片，均购于贵阳超研试剂公司。

1.2 菌株的分离与镜检

样本分为腐烂香肠的猪肠衣和羊肠衣2组，将肠衣上的黑斑区域分别剪成1 cm2大小，置于无菌平皿中进行细菌和真菌培养。

1)细菌培养。将2组样本分别接种于含有100 mL的CDB液体培养基的无菌锥形瓶(每组10个)，分别加入30%、25%、20%、18%、15%、10%、5%、2%、1%和0%(CK，不加入盐)的盐浓度中。

2) 真菌培养。将2组样本分别接种于含有100 mL的CDB液体培养基的无菌锥形瓶(每组10个)，分别加入1 mL链霉素，并分别加入30%、25%、20%、18%、15%、10%、5%、2%、1%和0%(CK，不加入盐)的盐浓度中。

将以上接种好的锥形瓶置于摇床上，25℃培养30～45 d，观察并记录微生物的生长情况。在30～45 d后，将高盐环境中(盐浓度>10%的液体培养基)生长的微生物转移接种在含有10%盐浓度的CDA固体培养基上，在25℃培养5d左右，通过形态学观察菌落特征，将生长的菌落接种在TSA固体培养基中，获得纯培养菌株。收集菌株的纯培养物，挑取单个菌落进行革兰染色形态观察，并将其悬浊液送至贵州医科大学电镜科室观察其形态结构。

1.3 DNA的提取与16S rRNA检测

将分离菌株接种于TSA培养基上，37℃培养72 h，收集培养物，采用玻璃珠法和CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)提取法[9]提取菌株DNA，吸光度法检测DNA浓度，并稀释成1 μg/μL冷冻备用。

综上所述，我们在小学生语文教学中，作为新世纪的人民教师应该加强学习，不断给自己充电，首先提高教师本身的创新意识和在教学上的创新，做教学的有心人。积极引入现代教育技术（如：多媒体教学及几何画板和各种直观教具）并引导学生积极探索，勇于质疑，敢于猜想，尚于归纳总结综合。在解证题目时常进行一题多变、一题多解的训练，使思维得到充分发散和收敛，为祖国的明天培养出更多的创造型人才。

以菌株基因组DNA为模板，细菌16S rRNA扩增通用引物27f：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(由上海生工生物工程股份有限公司合成)，在PCR扩增仪中扩增，扩增体系：PCR Mix13 μL，无菌双蒸水8.5 μL，27f、1492r和模板DNA各1 μL，MgCl20.5 μL，DMSO 1 μL。PCR反应程序：预变性95℃ 4 min，变性95℃ 30 s，退火59℃ 50 s，延伸72℃ 90 s，35次循环，终延伸72℃ 10 min。PCR结束后将扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，然后放于紫外灯下观察，并将PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果在GenBank中进行Blast基因序列比对，比对结果按16S rDNA基因序列相似性大于97%的菌株归于同一物种。

1.4 系统发育树的构建

将测序后获得的菌株16S rRNA序列在GenBank数据库进行相似性搜索，选取相似性较高的已发表的典型菌株作为参考对象，然后用CLUSTAL X1.83进行多重序列比对并计算测试菌株与参考菌株之间的序列相似性，剔除同一来源的重复序列，利用MEGA 5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis software 5.0)软件，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建菌株的系统发育树。

1.5 药物敏感性试验

Kirby-Bauey纸片扩散法进行药物敏感试验，操作和结果判读标准参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制订的标准：将分离鉴定的嗜盐细菌分别传于营养琼脂培养基上培养48 h，挑取菌落配置菌液浓度为0.5麦氏浊度，即分光光度计值0.08～0.10，调好浊度的菌悬液15 min内均匀涂布含有10%盐浓度的MH平板。平板涂好菌液后，放置5 min，无菌镊子贴相应的药敏纸片，保持纸片间间距大于40 mm。以金黄色葡萄球菌ATCC 25933作为质控菌株，35℃培养48 h，观察培养板中抑菌圈生长情况并记录结果，每组细菌样本5次重复。

2 结果与分析

2.1 不同盐浓度微生物的生长情况

取样镜检可知，细菌和真菌均出现在含低盐浓度及不含盐浓度环境中，可观察到杆状或球状细菌以及青霉菌和曲霉菌等真菌；微生物在含有链霉素的液体培养基中的生长速度较慢，在含有链霉素的高盐(>18%)环境中，未见真菌生长。而在不含链霉素的高盐(25%～30%)环境中，培养基较浑浊，呈淡粉色。表明，这些细菌有很强的耐盐能力。

注：A，菌株Gyfl1，大小为(1.5～1.9)μm×(0.3～0.6)μm； B，菌株Gyfl2，大小为(1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm； C，菌株Gyfl3，大小为(0.9～1.3)μm×(0.2～0.4)μm。

Note:A, Gyfl1 strain with size of (1.5～1.9 )μm×(0.3～0.6)μm; B, Gyfl2 strain with size of (1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm; C, Gyfl3 strain with size of (0.9～1.3)μm×(0.2～0.4 )μm.

图1 微生物细胞形态(×20K)的扫描电镜观察

Fig.1 Microbial cellular morphology under scanning electron microscopy(×20K)

2.2 微生物细胞形态(×20K)的扫描电镜观察

在高盐(25%～30%)液体培养基中生长的微生物，接种在CDA及TSA固体培养基进行分离纯化后，分离到3株形态大小、菌落表面凹凸度及边缘形态不一致的细菌，分别被命名为Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3。经革兰染色后在1 000×镜下观察可见，3株细菌呈短杆状，成双或短链状排列的革兰氏阴性菌。在电镜(×20K)下可见，Gyfl1呈短杆状，大多数单一排列，大小为(1.5～1.9)μm×(0.3～0.6)μm；Gyfl2呈短杆状成簇排列，大小为(1.3～2.1)μm×(0.4～0.6)μm；Gyfl3呈短杆状成簇排列，大小为(0.9～1.3)μm×(0.2～0.4)μm(图1)。

2.3 16S r RNA序列分析及系统发育树的构建

将16S r RNA序列分析测序结果在Pubmed基因库中搜索对比结果显示，3株细菌均属于中度嗜盐菌(Moderatelyhalophilicbacteria)。其中，Gyfl1为Halomonasvariabilis，Gyfl2为Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3为Chromohalobacter canadensis。根据比对结果，选择与3株细菌同源性较高的22株中度嗜盐菌16S r RNA序列，采用软件CLUSTAL X1.83及MEGA5.0，通过邻接法构建中度嗜盐菌的系统发育树，从图2看出，分离的菌株Gyfl1、Gyfl2及Gyfl3在进化亲缘关系最近的标准菌株分别为HalomonasvariabilisDSM3051T(AJ306893)、ChromohalobacterisraelensisATCC 43985T(AJ295144)、ChromohalobactercanadensisDSM 6769T(NR_114545)。

注：Zymobacter palmae DSM10491T(D14555)作为外群。

Note：Zymobacter palmae DSM10491T(D14555) is used as an outgroup.

图2 基于16S r RNA序列构建中度嗜盐菌的系统发育树

Fig.2 The phylogenetic tree of moderately halophilic bacteria based on 16S rRNA sequence structure

表 常见抗生素对嗜盐菌Gyfl1、Gyfl2及Gyfl3的药敏试验结果(x±s, n=5)

注：“-”表示无抑菌圈。

Note：“-“, without inhibition zone.

2.4 药敏试验

从表2可知，庆大霉素、卡那霉素、利福平、红霉素和新霉素等常见抗生素均能抑制嗜盐菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明显，每组样本抑菌圈之间均差异显著(P<0.05)。

3 小结与讨论

1)在香肠等农副产品中添加高浓度盐通常是延长食品储存期限的方法之一，盐渍香肠处于高盐环境中，一般细菌难以生长。研究结果表明，从腐烂香肠肠衣中分离到3株菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，经分子生物学等方法鉴定为中度嗜盐菌，Gyfl1为Halomonasvariabilis，Gyfl2为Chromohalobacterisraelensis，Gyfl3为Chromohalobactercanadensis，初步推断为引起香肠肠衣质变的腐败菌，这些细菌均在饱和盐浓度的液体培养基中分离出来，在高盐环境下可正常生长，说明其有特殊的耐盐特性。

2) 分离到的中度嗜盐菌(H.variabilis,C.israelensis,C.canadensis)属于Halomonadaceae科，是一类革兰氏阴性菌，且能适应极端环境的微生物类群[10-13]。中度嗜盐菌对环境具有极强的适应能力，广泛分布于自然界中，存在于盐湖、盐场、沙漠、高盐土壤和盐渍食物等各种环境[14]，是盐生生态系统的重要组成之一。嗜盐菌具有特殊的生理结构及细胞中含有的特殊物质使得嗜盐菌能够在高盐环境中生长[15]。早期，对高盐环境的研究主要集中于嗜盐古菌上，对中度嗜盐菌的研究相对较少。近年来，我国科研人员从不同盐环境中分离出许多新的嗜盐微生物，并得到了国际学术界的认可[16-20]。

3)盐单胞菌属(Halomonas)[21]为革兰氏阴性菌、好气杆菌和球菌类群中的一类微生物，是一类能在盐度为0%～32%(W/V)条件下生长的耐盐细菌，并且能在高压环境中生存[22]，而一些盐单胞菌曾被报道为条件致病菌[23]。本研究分离的Gyfl1被鉴定为盐单胞菌。色盐杆菌属(Chromohalobacter)于1989年被科学家Ventosa发现，并将Chromobacteriummarismortui重新分类为Chromohalobactermarismortui[24]，色盐杆菌常出现在酸性喷泉、放射性垃圾、深部地壳以及动物或植物体内[25]。C.canadensis常出现在盐渍食物中[26]；而C.israelensis曾被报道为植物内生菌，分离自一种典型的盐碱地指示植物盐地碱蓬(SuaedasalsaL)[27]，该植物生长在盐土、盐渍化土壤和沿海地带。本研究中，C.israelensis分离自腐烂香肠上，为首次在食物中发现。经药敏试验可知，庆大霉素、卡那霉素、利福平、红霉素和新霉素等常见抗生素均能抑制嗜盐菌株Gyfl1、Gyfl2和Gyfl3，而利福平抑菌效果更明显。农副产品在储存中产生腐烂现象，将对企业造成巨大的经济损失，应及时找出有效的应对措施降低其损失，研究结果可为工厂储存及包装相关农副产品时提供防腐参考。

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(责任编辑： 杨 林)

Isolation, Identification and Characteristics of Halophilic Bacteria in Decayed Black Spot of Sausage Casing

MU Lili1， TU Yunhua1， Syren de Hoog2， LIU Taohua1，LU Qian1， WANG Yanyan1， CHEN Yan1， KANG Yingqian1*

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China； 2.FungalBiodiversityCentre,CBS-KNAW,Utrecht85167,Netherlands)

The halophilic bacteria in decayed black spot of sausage casing were isolated and identified by the gradient salt concentration method (Czapek Dox Broth liquid medium), CDA (Czapek Dox Agar) and TSA (Trypticase Soy Agar) solid media, and the characteristics of the identified halophilic bacteria was analyzed by using 16S rRNA gene sequencing and building phylogenetic tree of 16S rRNAsequence to provide the theoretical basis for microbial identification and bacteriostat measures during the storage process of agricultural products and related foods produced by industrialization. Results: Three halophilic bacteria strains (Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3) are successfully isolated on the solid medium with 25%～30% salt concentration. Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3 strains are identified asHalomonasvariabilis,ChromohalobacterisraelensisandChromohalobacterCanadensis by molecular analysis respectively. The drug sensitive test shows that common antibiotics of gentamicin, kanamycin, rifampicin, erythromycin, and neomycin all can inhibit Gyfl1，Gyfl2 and Gyfl3 strains but the antibacterial effect of rifampicin is the highest among common antibiotics.

halophilic bacteria; sausage casing; phylogenetic tree; antibiotics sensitivity

2015-09-02； 2016-01-05修回

国家自然科学基金地方项目“贵州省病原需氧放线菌的系统分类研究及其属间快速鉴别诊断试剂盒的研发”(31260029)；贵州省国际科技合作计划项目“白酒丢糟及锅底水水解循环利用技术”"[黔科合外G字(2014)7006]；贵州省社会发展科技攻关项目“贵州省放线菌资源的开发及临床放线菌属间快速鉴别诊断试剂盒的研发”[黔科合SY 字(2011)3017]；贵阳市科技局科技创新平台计划项目“姜黄纳米保健产品科技创新平台的建设”[筑科合同2012303]

牟丽丽(1988-)，女，在读硕士，研究方向：病原生物学。E-mail:1019535819@qq.com

*通讯作者：康颖倩(1974-)，女，教授，博士，从事微生物的相关研究。E-mail:449164105@qq.com

1001-3601(2016)01-0025-0093-05

TS205.3

A