活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

崔阳阳，孙伟伟，赵瑞华*，徐彩，吴天思，2

(1.中国中医科学院广安门医院妇科，北京　100053；2. 北京中医药大学，北京　100029)



活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

崔阳阳1，孙伟伟1，赵瑞华1*，徐彩1，吴天思1，2

(1.中国中医科学院广安门医院妇科，北京100053；2. 北京中医药大学，北京100029)

【摘要】目的评估活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的影响。方法根据胚胎供体小鼠(中药组、模型组和假手术组)和接受胚胎移植的假孕小鼠(中药组、模型组和假手术组)的来源，两两组合，将实验分为9组进行IVF-ET，移植7 d后，观察不同条件下的妊娠率及活胎率。结果IVF-ET后，9组小鼠的妊娠率比较有显著性差异(P<0.05)。通过分组比较，中药-假手术组、模型-假手术组及假手术-假手术组的IVF-ET妊娠率有显著性差异(P<0.05)；假手术-中药组、假手术-模型组及假手术-假手术组的IVF-ET妊娠率有显著性差异(P<0.05)。9组活胎率由高到低依次为假手术-假手术组、假手术-中药组、中药-中药组、中药-假手术组、中药-模型组、假手术-模型组、模型-假手术、模型-中药组、模型-模型组，组间比较有显著性差异(P<0.05)。结论活血消异方可提高模型小鼠IVF-ET的妊娠率及活胎率。

【关键词】子宫内膜异位症；不孕；体外受精-胚胎移植

(JReprodMed2016，25(2)：166-171)

子宫内膜异位症(EM)简称内异症，是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在宫腔以外部位的一种雌激素依赖性疾病。内异症是育龄妇女的常见病、多发病，以疼痛和不孕为主要特点。有数据显示近年来内异症的发病率呈现逐年上升的趋势，且发病年龄趋于年轻化。内异症与女性不孕密切相关，有研究报道高达40%～60%的内异症患者合并不孕症[1]，而不孕症患者中约40%～50%的人存在内异症。内异症是引起女性不孕的主要原因之一，内异症患者合并不孕症的风险为非内异症人群的20倍[2]。2000年Buyalos等[3]首次提出“内异症相关不孕症”(Endometriosis-associated infertility)的概念。

随着辅助生殖技术(ART)的发展及临床应用，ART逐渐成为内异症相关不孕症患者最理想的助孕方式和治疗手段。有研究报道，内异症相关不孕症患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗时胚胎移植率可达85%，但妊娠率仅为20%左右[4]。因此，如何提高这类患者助孕治疗的妊娠率成为生殖领域医生关注的热点问题。这种高移植率和低妊娠率的现象提示，胚胎着床可能是影响其妊娠结局的关键性问题。前期研究发现，活血化瘀治疗不仅能改善内异症的临床症状，还对合并不孕的患者有明显的助孕作用，活血消异方能缩小异位内膜体积、改善内异症的组织病理形态；有效降低异位内膜组织中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白的表达[5]。本研究以中医理论为指导，通过建立内异症小鼠模型，结合IVF-ET技术，观察内异症模型小鼠胚胎发育的情况及妊娠结局，探讨活血消异方对内异症相关不孕症患者妊娠结局的影响。

材料和方法

一、实验材料

1. 实验动物：选择健康、性成熟的SPF级昆明雌性小鼠300只，7周龄，体重(25±3)g；昆明雄性小鼠50只，10周龄，体重(33±2)g。所有实验动物购自中国医学科学院动物所[SCXK(京)2009-0007]。实验动物饲养于中国中医科学院广安门医院SPF级动物实验室，光照明暗时间为12/12 h，室温22℃。饲养动物所需的笼具及饮水瓶均由专业饲养人员高压灭菌后提供。昆明小鼠雌鼠用于模型小鼠的供体与受体，昆明雄性小鼠用于精子供体及假孕鼠制作。

2. 主要试剂和药物：HTF和KSOM 培养液 (ARK-Resource，日本)；人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素(PMSG)均购自宁波第二激素厂；羧甲基纤维素钠(Solarbio，北京)；矿物油(Sigma，德国)；嘴吹管及移植针(Sigma，德国)。其他实验材料、试剂及药物(包括中药)全部由广安门医院制剂室提供。其中HTF用于体外受精，KSOM用于培养受精卵直至囊胚期，培养液使用前于5%CO2、恒温37℃、湿度饱和的培养箱中过夜预热平衡。

中药活血消异方由莪术、丹参、赤芍、鸡内金、生薏仁组成，由广安门医院制剂室提供。上述生药加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并煎液、过滤，放置24 h，浓缩。药物浓度为1.8 g生药/ml，药液4℃冰箱保存。

二、研究方法

1. 实验分组：按照2细胞与假孕鼠(详见后文描述)不同组别的来源，将实验小鼠分为9组进行IVF-ET，具体分组情况见表1。

表1　实验小鼠进行IVF-ET的分组

2. 内异症小鼠模型的建立及处理：将实验雌性昆明小鼠分为中药组、模型组和假手术组进行内异症小鼠模型的建立。选择动情周期正常的小鼠，通过内膜碎片注射法[6-7]建立内异症模型小鼠，假手术组给予等量生理盐水注射。模型建立2周后，开始进行中药干预。依据换算公式计算，小鼠等剂量的给药量约为临床成人每公斤体重用药量的10倍。每只小鼠每次灌胃量为0.2 ml/10 g，连续 3个周期(5 d为1周期)。模型组、假手术组依据体重给予等量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。

3. 促排卵及卵母细胞的采集：各组分别取供卵鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，48 h后腹腔注射HCG 10 U/只。注射HCG 14 h后进行取卵。脱颈处死供卵小鼠后打开小鼠腹腔，剥离组织，寻找子宫、输卵管、卵巢和脂肪垫，这时可见子宫系膜，其连接生殖道和体腔壁，并带有明显的血管。用镊子将输卵管、卵巢和脂肪垫拉出，用小剪刀剪开输卵管和卵巢，并将靠近输卵管的子宫部剪下。将输卵管携带子宫的部分置于培养滴中，移至体视显微镜(ZOOM2000，Leica，德国)下进行操作，用16号针轻轻划破输卵管膨大的壶腹部，可见云雾状的卵母细胞及卵丘团释放出来，将卵丘团引入HTF培养滴中。将取出的卵母细胞置于5%CO2、恒温37℃、湿度饱和的培养箱中待用。

4. 精子的采集：脱颈处死雄性小鼠，开腹进入腹腔剪下睾丸及附睾，迅速分离出附睾尾和输精管，并尽可能去除脂肪和血管。在体视显微镜下，使用26号针于附睾尾远端小管处刺破，慢慢挤出精子，挑出精子置于HTF培养滴中，将培养皿放入培养箱中静置1 h使精子获能。受精时，调整精子浓度约为(1～2)×106个/ml。

5. IVF：精子获能后，将精子加入卵母细胞培养皿中，置于培养箱中静置6 h。6 h后使用HTF冲洗受精卵2～3次，冲洗后将受精卵置于新鲜的KSOM培养液中，在倒置显微镜下对受精卵进行计数后，重新置于培养箱中培养。受精24 h后，可见到较早卵裂的2细胞。部分2细胞培养至囊胚，观察卵裂及胚胎发育情况；部分进行2细胞移植的2细胞供体。

6. 胚胎移植[8]：将性成熟的雌性小鼠与输精管结扎术后的雄性小鼠合笼，次日上午9：00检查雌鼠阴道涂片，见阴道栓者为假孕鼠，计为0.5 d。以此假孕鼠作为胚胎移植的受体鼠。挑选0.5 d假孕鼠，以0.9%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，刮净假孕鼠脊背下部并进行常规消毒。把小鼠移到体视显微镜下，距脊柱左侧约1 cm处横向切一小口，钝性分离组织，暴露卵巢及脂肪垫，夹起脂肪垫，拉出左侧卵巢、输卵管及子宫，将输卵管和卵巢留置体外。在移卵管吸入2细胞前，为了使移植时操作过程易于控制，首先吸入少量矿物油及气柱，再拾入15枚2细胞，将2细胞从小鼠输卵管伞端吹入后，将小鼠从显微镜台上移下，将脂肪垫、子宫、输卵管及卵巢放回体内，1～2针缝合体壁。重复以上步骤转移胚胎至右侧输卵管。缝合皮肤，放回笼中待苏醒。每只假孕鼠每侧子宫移植15枚2细胞。在胚胎移植7 d后，脱颈处死小鼠，观察胚胎移植后小鼠的妊娠率及活胎率。

活胎及活胎率的判断标准[9]：活胎数：妊娠7 d，孕体鲜明，判为存活。活胎率计算公式：活胎率=存活的胚胎数/移植胚胎数。

三、统计方法

采用SPSS 17.0软件包进行数据分析，计数资料采用χ2检验，当总频数n≥40且所有理论频数≥5时，用Pearsonχ2统计量；在总频数n>40但理论频数≥1时，用校正χ2统计量；在总频数n<40或理论频数<1时，用Fisher确切概率法检验，组间比较采用两两四格表的χ2检验。按α=0.05水准，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、内异症小鼠模型建立

内异症模型小鼠可见皮下和腹腔均有病灶生成，且异位病灶生长良好。小鼠皮下病灶，肉眼观多为白色、红色或淡黄色米粒大小的结节或囊状病灶，活动度小；腹腔内病灶，肉眼观多为隆起囊状，囊内充满淡黄色清亮透明或混浊粘稠积液，表面血管清晰可见，病灶2～5 mm3大小不等。小鼠皮下及腹腔有不同程度的黏连。内异症小鼠模型病灶组织HE染色结果见图1：异位病灶中有血管生成，并有大量腺体和间质存在。此前预实验观察，建模共14只小鼠，1只未在腹腔及皮下找到病灶，仅见腹腔及皮下黏连，成功建模13只。同时在本实验中观察，90%以上的模型小鼠有上述异位病灶生成，提示“腹腔+皮下”注射法建立内异症模型小鼠的成功率约达90%以上。

A：正常小鼠子宫内膜，箭头所指为正常子宫内膜腺体及血管；B：内异症模型小鼠子宫异位病灶，箭头所指为异位病灶生成的腺体和血管图1　正常小鼠子宫内膜与内异症模型小鼠子宫异位症灶 HE染色，×200

二、活血消异方对内异症模型小鼠IVF-ET妊娠率的影响

通过3组不同来源的胚胎和3组不同来源的假孕鼠进行IVF-ET后，观察其妊娠情况(表2)。通过Fisher精确概率法检验，9组小鼠IVF-ET后的妊娠率比较具有显著性差异(P=0.000)。

表2　各组小鼠IVF-ET后妊娠情况(n，%)

注：中药-模型组与模型-模型组中分别有1只小鼠因腹腔内严重黏连无法进行移植

根据胚胎和假孕鼠的来源，进行分组比较。假孕鼠来源于假手术组的3组进行比较，通过Fisher精确概率法检验发现，模型-假手术组的妊娠率显著低于中药-假手术组和假手术-假手术组(P<0.05)；中药-假手术组和假手术-假手术组的妊娠率比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3　假孕鼠来自假手术组的各组IVF-ET

注：与中药-假手术组和假手术-假手术组比较，*P<0.05

胚胎来源于假手术组的3组进行比较，通过Fisher精确概率法检验发现，假手术-模型组的妊娠率显著低于假手术-中药组和假手术-假手术组(P<0.05)；假手术-中药组和假手术-假手术组的妊娠率比较无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4　胚胎来源于假手术组的各组IVF-ET

注：与假手术-中药组和假手术-假手术组比较，*P<0.05

三、活血消异方对内异症模型小鼠IVF-ET活胎率的影响

通过IVF-ET技术观察并比较各实验组的活胎率，因百分率资料不服从正态分布，采用Kruskal-Wallis H非参数检验，9组小鼠的活胎率比较有显著性差异(Chi-Squareχ2=40.226，P=0.000)。根据平均秩次，9组小鼠的活胎率由高到低依次为假手术-假手术组、假手术-中药组、中药-中药组、中药-假手术组、中药-模型组、假手术-模型组、模型-假手术、模型-中药组、模型-模型组(表5)。

讨论

古代中医文献中未对内异症的病名进行记载，但根据内异症的病因、病理机制及临床表现可归于“痛经”、“癥瘕”、“不孕”和“月经不调”等疾病的范畴。中医认为血瘀为内异症的病理机制，瘀血是内异症的主要致病因素和病理产物。瘀血阻滞，不通则痛；血瘀日久，可成癥积。我院李光荣教授以“离经之血”立论，组成系列方药，其中以核心药物(丹参、赤芍、莪术等)组成活血消异方，临床疗效显著[5，10]。方中丹参，或癥瘕积聚而胀闷痞塞[11]，有活血调经、祛瘀止痛之功效。赤芍出自《神农本草经》，有活血祛瘀、散瘀止痛之功。素杲云“赤芍药破瘀血疗腹痛”[12]。莪术，用于血瘀或气滞血瘀之经闭腹痛、瘀阻、癥瘕积聚[13]，始载于《药性论》，能入气分血而行气血之滞，有破血祛瘀、行气消积止痛之功。活血消异方以丹参、赤芍、莪术相伍，共奏活血化瘀、散结止痛之效。

目前，国内外内异症模型的实验动物主要有兔、鼠及灵长类动物等，主要的建模方法包括传统的自发性动物模型和诱发性动物模型(包括自体移植和异体移植)以及一些新型的特殊内异症动物模型[14]。本研究中实验动物选择现阶段国内内异症相关研究最为常用的小鼠作为实验对象，其动情周期短而规律，性成熟早，繁殖力强。由于实验程序相对复杂且时间较长，本研究选择子宫内膜“皮下+腹腔”注射法建立模型，保留小鼠完整的子宫，便于观察病灶，并能减少手术操作的刺激和对盆腔微环境的影响，同时也能减少动物感染的几率和对其生命力的损伤，保证实验的可实施性，为后续实验的顺利进行提供保障。利用动物模型可以探讨内异症影响妊娠功能的可能机理、药物对妊娠功能相关的分子生物学影响以及改善妊娠功能的治疗等。

有文献指出，小鼠行胚胎异体移植并不影响妊娠结局[15]，本研究亦是基于胚胎异体移植不会影响实验结果来进行交叉分组设计。本研究通过建立内异症小鼠模型，结合IVF-ET技术，观察活血消异方对内异症模型小鼠行IVF-ET后妊娠率和活胎率的影响，通过3组不同来源的胚胎和3组不同来源的假孕鼠进行IVF和ET，观察9组小鼠胚胎移植后7 d的妊娠率及活胎率。结果显示，内异症可能影响小鼠的胚胎质量和子宫内膜环境，进而降低IVF-ET后的妊娠率及活胎率，活血消异方可以提高内异症模型小鼠IVF-ET后的妊娠率及活胎率，提示其可能有助于改善胚胎质量及子宫内膜环境，提高子宫内膜容受性，促进胚胎着床和胚胎生长发育。

越来越多的证据表明，内异症相关不孕症与胚胎质量和子宫内膜容受性有密切关系。中医治疗在改善子宫内膜容受性和胚胎质量上取得了一定肯定的效果。有研究报道，补肾活血治疗可以提高内异症患者子宫内膜容受性，诱发成熟卵泡排卵，促进黄体发育，提高黄体功能[16-17]。王艳妮等[18]研究发现对内异症患者IVF-ET周期的各阶段采用补肾活血法治疗，可获得良好的妊娠率。随着ART的应用普及，为一些内异症相关不孕症患者带来福音，有研究者认为，轻度内异症患者通过适当的期待妊娠后仍未妊娠者，就可以积极采取ART助孕治疗[19]，但临床实际中ART并不能解决所有问题，它可能绕过某些与内异症相关的基础疾病，但疾病本身可能影响助孕治疗的结局。因此，如何安全、有效地提高内异症患者助孕治疗的妊娠率，是中西医领域共同面临的难题。

综上所述，本研究结果提示活血消异方可以有效改善内异症相关不孕症患者的妊娠结局，为中医药治疗提高内异症患者的临床妊娠率提供科学依据，并为进一步探讨中医药在内异症辅助生殖领域中的应用奠定基础，但后续仍需进一步的深入研究其可能的作用机理及分子生物学调控机制。

【参考文献】

[1]张惜阴. 实用妇产科学[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版，2003：745-749.

[2]Birmingham A. Endometriosis and infertility [J]. Fertil Steril，2004，81：1441-1446.

[3]Buyalos RP，Agarwal SK. Endometriosis-associated infertility [J]. Curr Opin Obstet Gynecol，2000，12：377-381.

[4]Barnhart K，Dunsmoor-Su R，Coutifaris C. Effect of endometriosis on in vitro fertilization [J]. Fertil Steril，2002，77：1148-1155.

[5]赵瑞华，杨艳环，李敏，等. 活血消异方对子宫内膜异位症大鼠 ICAM-1、MMP-9 及 VEGF 的影响 [J]. 北京中医药大学学报，2012，35：826-829.

[6]马丽，谢淑武，朱焰，等. 注射法小鼠皮下子宫内膜异位症模型及组织学观察 [J]. 中国实验动物学报，2008，16：192-195.

[7]郭方，徐丛剑. 腹腔注射甲氨蝶呤对小鼠异位内膜生长的影响 [J]. 中国实用妇科与产科杂志，2007，23：692-694.

[8]Achache H，Revel A. Endometrial receptivity markers，the journey to successful embryo implantation [J]. Hum Reprod Update，2006，12：731-746.

[9]刘光芒，吴德，张明，等. 铁与维生素A水平对小鼠子宫分泌蛋白及胚胎存活率影响 [J]. 动物营养学报，2007，19：392-400.

[10]杨艳环，赵瑞华，徐彩. 活血消异方对子宫内膜异位症复发风险大鼠模型的影响 [J]. 中华中医药杂志，2012，27：1911-1913.

[11]吴昌国. 中医历代药论选[M]. 北京：中国中医药出版社，2010：102-103.

[12]苗明三，王智民. 对药的化学药理与临床[M]. 第1版. 北京：军事医学科学出版社，2002：912.

[13]翁维健，庞俊忠，沈连生. 临床用药鉴别[M]. 北京：北京中医学院，1981：150-151.

[14]崔阳阳，孙伟伟，赵瑞华. 子宫内膜异位症动物模型研究进展 [J]. 中国实验动物学报，2013，21：86-89.

[15]王敏康，刘冀珑，李劲松，等.小鼠的胚胎移植方法 [J]. 动物学杂志，2000，35：31-34.

[16]杨桂云，刘红林. 补肾活血方对子宫内膜异位症不孕腹腔液微环境改善作用的实验研究 [J]. 中医药学刊，2003，21：57-59.

[17]具春花，陈玲. 补肾活血方对内异症伴不孕患者子宫内膜的影响 [J]. 辽宁中医杂志，2008，35：722-723.

[18]王艳妮，谈勇. 补肾活血法在子宫内膜异位症不孕患者行试管婴儿术中的应用体会 [J]. 实用中医药杂志，2010，26：264.

[19]李脉，周黎明，孙亦婷，等. 子宫内膜异位症患者行体外受精-胚胎移植结局分析 [J]. 生殖医学杂志，2015，24：386-391.

[编辑：陆彩玲]

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本刊编辑部

Effects of Huoxue Xiaoyi Fang on embryo development after IVF-ET in endometriosis model mice

CUIYang-yang1，SUNWei-wei1，ZHAORui-hua1*，XUCai1，WUTian-si1,2

1.DepartmentofGynecology，Guang’anmenHospital，ChinaAcademyofChieseMedicalSciences，Beijing100053

2.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029

【Abstract】

Objective： To evaluate the effect of Huoxue Xiaoyi Fang on pregnancy outcome after IVF-ET in endometriosis (EM) model mice.

Methods： According to the sources [traditional Chinese medicine (TCM) group，EM model group，Sham-operation group] of mice of embryos donor and pseudopregnant mice accepted embryos transfer，the mice were divided into nine groups for IVF-ET after One-to-one cross combination. The pregnancy rate and the live embryo rate after 7 days of embryo transplantation (ET) were observed and compared among the nine groups.

Results： The pregnancy rate of nine groups were significantly different (P<0.05). The pregnancy rate after IVF-ET was significantly different among TCM-Sham operation group，EM model-Sham operation group and Sham operation-Sham operation group (P<0.05). The pregnancy rate after IVF-ET were significantly different among Sham operation-TCM group，Sham operation-EM model group and Sham operation-Sham operation group (P<0.05). The live embryo rate of nine groups were sequenced from high to low as follows：Sham operation-Sham operation group，Sham operation-TCM group，TCM-TCM group，TCM-Sham operation group，TCM-EM model group，Sham operation-EM model group，EM model-Sham operation group，EM model-TCM group and EM model-EM model group，and the differences were significant among the groups(P<0.05).

Conclusions： Huoxue Xiaoyi Fang can improve the pregnancy rate and the live embryo rate after IVF-ET.

Key words：Endometriosis；Infertility；IVF-ET

【作者简介】崔阳阳，女，山西太原人，硕士，中医妇科学专业.(*通讯作者，Email：rhzh801@126.com)

【基金项目】国家自然科学基金(No. 81173297)

【收稿日期】2015-05-25；【修回日期】2015-07-12

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.012