卵泡刺激素和干细胞因子对大鼠非梗阻性无精子症模型生精功能的影响

曹宇，刘仲伟，孟昱时，程波，邱学德，李志鹏，曹贵华，何进，和术臣

(1. 昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，昆明　650101；2. 湖南中医药大学附属宁乡医院泌尿外科，长沙　410600；3. 滕州市中心人民医院泌尿外科，滕州　277500；4. 昆明医科大学第二附属医院男性科，昆明　650101；5. 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，昆明　650101)



卵泡刺激素和干细胞因子对大鼠非梗阻性无精子症模型生精功能的影响

曹宇1，2，刘仲伟1，孟昱时1，程波3，邱学德4*，李志鹏5，曹贵华5，何进5，和术臣5

(1. 昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，昆明650101；2. 湖南中医药大学附属宁乡医院泌尿外科，长沙410600；3. 滕州市中心人民医院泌尿外科，滕州277500；4. 昆明医科大学第二附属医院男性科，昆明650101；5. 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，昆明650101)

【摘要】目的探讨卵泡刺激素(FSH)、干细胞因子(SCF)对Wistar大鼠非梗阻性无精子症(NOA)动物模型生精功能的影响。方法使用白消安15 mg/kg单次腹腔注射制作Wistar大鼠NOA动物模型，抽样检查模型制造成功后。随机抽取72只大鼠分为两组：治疗组给予大鼠后腿肌肉注射FSH 250 mU/次和SCF 150 ng/次，每3 d重复注射1次，共注射19次；对照组予以等量的生理盐水行大鼠后腿肌肉注射。治疗组和对照组均于用药后19 d、38 d和57 d摘取一侧睾丸制成石蜡病理切片，采用Johnsen法评价其生精功能；取一侧附睾计数附睾尾精子数，每组每次12只。结果治疗组用药19 d、38 d和57 d睾丸组织切片Johnsen评分均显著高于对照组(P均<0.05)；用药后19 d 和38 d治疗组睾丸内曲细精管排列较对照组紧密、整齐；管腔内各级生精细胞数量亦多于对照组；用药后57 d治疗组睾丸内曲细精管与正常睾丸基本一致，而同期对照组内有不少曲细精管局部呈现“空泡样”结构。用药后19 d，两组附睾内均未见精子；用药38 d时治疗组附睾内精子数[(77.55±55.18)个/ml]显著高于对照组[(41.05±29.20)个/ml](P<0.05)；用药57 d时治疗组附睾内精子数[(122.13±80.67)个/ml]亦显著高于对照组[(58.50±26.15)个/ml](P<0.05)。结论FSH联合SCF肌注能够促进Wistar大鼠NOA模型生精功能的恢复。

【关键词】非梗阻性无精子症模型；卵泡刺激素；干细胞因子；生精功能

Effect of FSH and SCF on spermatogenesis of non-obstructive azoospermia in rat models

CAOYu1，2，LIUZhong-wei1，MENGYu-shi1，CHENGBo3，QIUXue-de4*，LIZhi-peng5，CAOGui-hua5，HEJin5，HEShu-chen5

1.DepartmentofReproductiveMedicine，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101

(JReprodMed2016，25(2)：160-165)

非梗阻性无精子症(NOA)因为精液中缺乏精子，临床上一度缺少有效的治疗方法，随着人类辅助生殖技术的诞生和快速发展，使得NOA患者的治疗出现了突破性的进展。然而对于那些睾丸内无精子生成的NOA患者，目前临床上仍然缺乏有效的治疗手段。有研究报道FSH可以通过改善精子的超微结构和精子线粒体DNA的聚合，提高精子质量与浓度[1]，干细胞因子(SCF)可促进A型精原细胞DNA的合成[2]，在原始生殖细胞和精原细胞的粘附、迁移、增殖和存活中也发挥着重要作用[3]。本研究利用白消安单次腹腔注射建立Wistar大鼠NOA动物模型，并通过将FSH和SCF联合注射于NOA模型，探讨FSH和SCF对大鼠NOA模型生精功能的影响，现将结果报告如下。

材料与方法

一、研究对象

1. 实验动物：选用SPF级成年雄性Wistar大鼠150只，体重220～280 g[实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0012，实验动物质量合格证号：HNACSDC20100520]。

2. 主要试剂及图像分析系统：Bouin's液，由昆明医科大学病理科提供，使用前配制；FSH、SCF、白消安(Sigma，美国)；伊红(The Coleman & Bell，美国)；苏木素(上海化学试剂)；显微摄影系统DM4000B、数码相机DFC320、摄影软件IM50(Leica，德国)；HPIA-2000高清晰度病理图文分析系统(同济大学)；病理切片的制作及观察均由昆明医科大学病理科钱忠义老师帮助完成。

二、研究方法

1. 大鼠NOA模型的制作和检测：采血检测成年雄性大鼠血清性激素水平，排除有内分泌疾病者(该部分实验由昆明医科大学第二附属医院检验科陈江医生协助完成)。对成年雄性大鼠予以白消安15 mg/kg单次腹腔注射[4]，38 d后从存活的大鼠中，随机抽取10只大鼠取一侧睾丸和附睾作组织切片，以睾丸切片见不到精子细胞和精子，附睾切片内见不到精子为标准，并与正常大鼠的睾丸和附睾切片比较，检验大鼠NOA模型是否成功。

2. 动物模型分组和用药方式：取72只NOA模型大鼠随机分为两组。治疗组36只，于大鼠后腿肌肉注射 FSH 250 mU/次和SCF 150 ng/次，每3 d重复注射1次，共注射19次；对照组36只，给予同等体积的生理盐水行大鼠后腿肌肉注射，次数与实验组相同。

3. 标本采集：治疗组和对照组均于用药后19 d、38 d和57 d摘取一侧睾丸制备石蜡切片；取一侧附睾行计数附睾尾精子数，完整剪下附睾尾，置于1 ml生理盐水中剪碎组织，37℃水浴10 min后，用吸管吹出精子使之游离，离心后计数精子数；每组每次12只。

4. 标本观测指标：切片制成后，每份标本观察25个垂直切面，Johnsen评分评价睾丸组织生精功能，其评价标准[5]为：完好的精子发生为10分；各级生精细胞存在但排列紊乱者为9 分；仅有少量精子(>10个)者为 8分；无精子但有大量精子细胞者为7 分；无精子仅有少量精子细胞(5～10个)者为6分；无精子但有较多精母细胞者为 5 分；无精子细胞仅有个别精母细胞(<5个)者为 4 分；仅有精原细胞为 3 分；无生精细胞仅有支持细胞为2 分；管腔内无细胞为1 分。另外，对附睾管内精子数进行计数。

三、统计学分析

结果

一、大鼠NOA模型建立

注射白消安38 d后，随机抽取10只建模大鼠，取一侧睾丸和附睾作组织切片，组织形态学显示：建模大鼠睾丸萎陷，睾丸血供较差；附睾形态基本正常，颜色较晦暗。光镜下可见：睾丸生精小管萎缩，支持细胞数量减少，各级生精细胞基本消失，排列紊乱；生精小管腔隙扩大，出现“空泡样”改变。附睾管仅存附睾管上皮细胞，管腔内见不到精子(图1A、B)。认为大鼠NOA模型建立成功。

A：睾丸　　　　　　　　　　　　　　　B：附睾图1　建模大鼠睾丸、附睾切片 HE染色，×400

二、正常大鼠睾丸、附睾的组织形态观察

正常大鼠的睾丸切片内可见形态正常的曲细精管，排列紧密，界线清晰;管腔内各级生精细胞排列规整，可见大量形态正常的精子;支持细胞数量正常、形态饱满。附睾管腔排列紧密，形态规整，上皮细胞呈单层有序排列，管腔内可见大量的精子，且形态良好(图2A、B)。

A：睾丸　 　　　　　　　　　　　　B：附睾图2　正常大鼠睾丸、附睾切片 HE染色，×400

三、不同用药时间两组大鼠睾丸组织形态观察

用药19 d后，与对照组比较，可见治疗组睾丸切片内曲细精管排列紧密，曲细精管间的血管较对照组多，血管管腔也较对照组大。曲细精管管腔内，各级生精细胞数量较对照组多，排列整齐，且细胞形态和饱满程度与正常生精细胞基本一致。治疗组内的“空泡样”结构亦较对照组少(图3 A、B)。

A：用药19 d治疗组；B：用药19 d对照组；　　　　C：用药38 d治疗组；D：用药38 d对照组；　　　　E：用药57 d治疗组；F：用药57 d对照组图3　不同用药时间大鼠睾丸组织形态观察 HE染色，×400

用药38 d后，可见治疗组睾丸切片内曲细精管排列较对照组规则、整齐，管腔内可见各级生精细胞排列规整，且各级细胞数量亦较对照组多；曲细精管间的血管较对照组多；支持细胞形态较饱满。对照组内可见少量“空泡样”组织结构(NOA模型成功后的结构)，而治疗组几乎没有(图3 C、D)。

用药57 d后，治疗组睾丸切片内曲细精管排列规则、整齐，基本与正常睾丸组织一致；且可见较多血管，血管管腔大，提示局部血供较好。对照组内则可见部分曲细精管及各级生精细胞恢复，显示出较明显的各级生精细胞的层次结构，但仍有不少曲细精管局部呈现出“空泡样”结构，甚至整个曲细精管内找不到生精细胞；血管形态相对不明显(图3E、F)。

六、不同用药时间两组睾丸Johnsen评分及附睾精子计数比较

用药后不同时间，治疗组睾丸Johnsen评分均显著高于对照组(P均<0.05)；用药后第19天，两组附睾内均未见精子，用药后第38、57天，治疗组附睾内精子数显著高于对照组(P均<0.05)(表1)。

表1　不同时间两组睾丸Johnsen评分及

注：与对照组同一时间比较，*P<0.05

讨论

自ICSI用于临床以来，帮助很多NOA患者获得了生育。理论上只要获得少量精子，NOA患者就可以通过ICSI获得生育机会。然而，即使采用睾丸取精成功率最高的显微切割睾丸精子抽吸术，仍有近一半的NOA患者睾丸内无法找到精子[7]。但也有学者研究发现NOA睾丸取精失败者即使睾丸内无精子，也多能在睾丸组织的局部发现残存的各级生殖细胞[7-8]。

有研究报道，行生殖细胞体外成熟培养时，在培养基中加入高浓度的FSH和睾酮(T)，可提高精子分化生成的速度，表明增加激素浓度有利于激素与其受体有效结合，促进精子生成与分化，且能有效抑制生精细胞的凋亡[9]。体外培养的研究结果提示NOA患者睾丸组织中残存的生殖细胞是可以增殖分化的。

在激素对精子发生的调控过程中，支持细胞处于核心地位，其中FSH与生殖过程密切相关，FSH是雄性精子发育以及支持细胞生长的基础[10]。FSH与支持细胞膜上的卵泡刺激素受体(FSHR)结合，激活环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、钙离子通道等信号通路，将来自FSH的信号转化为生精细胞所需要的各种因子信号，促进生精过程[11-12]。有研究证实，FSH不仅可以促进早期生精细胞发育和精原细胞的分裂，还可以作用于间质细胞，分泌雄激素结合蛋白，促进精子生成；并通过改善精子超微结构和精子线粒体DNA的聚合提高精子的浓度和活动力[1，13]。Dorrington等[14]通过研究发现，在大鼠婴幼儿时期，注射FSH可以促进睾丸支持细胞的有丝分裂。在动物研究中发现，注射FSH可以诱导未成熟小鼠精子发生，并促进性早熟[15]。Jafarian等[16]通过将FSH和戊酸雌二醇注射于白消安制成的小鼠无精子症模型，发现单独注射FSH可促进生精功能的恢复。

支持细胞还可以产生SCF，SCF是c-kit酪氨酸激酶受体的配体，是原始生殖细胞体外培养存活所必须，在睾丸发育过程中，其与原始生殖细胞、精原细胞的粘附、迁移、增殖和存活密切相关，并刺激原始生殖细胞和A型精原细胞的DNA合成[17]。在成人睾丸中，支持细胞受到FSH刺激以后，c-kit受体可在除生殖干细胞以外的各级精原细胞中表达；在体外培养中FSH可防止生殖细胞凋亡，随着FSH刺激的增加，SCF水平相应升高[3]。表明FSH可能通过SCF-c-kit通路发挥对生殖细胞的保护作用。在睾丸功能失调患者的体内存在SCF/c-kit基因表达的缺陷，在生精障碍和无精子症患者体内生精细胞凋亡过程的增加也和SCF/c-kit表达的减少存在联系[18]。Yan等[3]将曲细精管在有或无SCF刺激的条件下进行体外培养，通过DNA梯状条带和原位末端标记染色测定细胞凋亡，发现SCF处理组较对照组细胞凋亡发生时间较晚，凋亡程度也较低；当SCF缺乏时，FSH对生殖细胞的保护作用随之下降。在使用白消安制成的大鼠NOA模型中，睾丸组织内SCF/c-kit的调节通路发生改变，使转录因子E2F处于无活性状态，不能正常启动增殖细胞核抗原基因的转录，并使G1期特定蛋白表达受到抑制，诱导生殖细胞的凋亡[19]。Plotton等[20]在一项研究中使用免疫组织化学的方法，比较49例正常生精、生精功能低下、生精阻滞、唯支持细胞综合征患者睾丸组织中SCF的表达情况，发现生精功能低下、生精阻滞和唯支持细胞综合征患者睾丸组织中SCF的表达较正常对照组降低。

综上所述，本研究结果显示FSH、SCF对NOA大鼠模型有较明显的治疗效果，能明显改善生精功能，提示对于NOA患者，也许可以通过补充外源性的FSH和SCF，提高体内FSH和SCF浓度，促进生殖细胞分裂分化为精子，以期改善NOA患者助孕治疗的结局。但本研究为动物实验，旨在提供一个研究思路，后期尚需要进一步的研究和探讨。

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[编辑：郭永]

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本刊编辑部

2.DepartmentofUrology，NingxiangHospitalAffiliatedtoHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410600

3.DepartmentofUrology，theCentralHospitalofTengzhou，Tengzhou277500

4.DepartmentofAndriatrics，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101

5.DepartmentofUrology，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming

650101

【Abstract】

Objective： To assessment the influence of FSH and stem cell factor (SCF) on the spermatogenic function in rat models of non-obstructive azoospermia.

Methods： The 72 rat models of non-obstructive azoospermia were prepared by injecting busulfan at a dose of 15 mg/kg into the abdominal cavity for each rat. The rat models were divided into two groups after successful establishment. The rats in treatment group were injected with 250 mU FSH and 150 ng SCF into hind leg muscle，every three days for 19 times. The rats in the control group were given equal amount of normal saline in the same way. The unilateral testis and epididymis of the rats were respectively obtained for morphological examination or sperm count on the 19th，38thand 57thday after administration. The spermatogenesis was evaluated by Johnsen score，and the sperm number in unilateral epididymis was accounted by CASA，twelve rats for each time.

Results： The Johnsen scores of the rats in the treatment group were significantly higher than those in the control group on the 19th，38thand 57thday after administration (P<0.05). The arrangements of seminiferous tubule of the treatment groups were more tightness than the control groups，and the number of spermatogenic cells at all stage in the lumen in the treatment groups were more than the control groups on the 19thor 38thday after administration. The morphology of seminiferous tubules in the treatment group was similar as normal testis，while that in the control groups showed "vacuole-like" structure on the 57thday after administration. There was no sperm in the epididymis tube in both of treatment and control group on the 19thday after administration. The sperm counts in the epididymis tube in treatment group on the 38thday after administration [(77.55±55.18)/ml] were significantly higher than those in the control group [(41.05±29.20)/ml] (P<0.05)，and it was similar on the 57thday after administrating [(122.13±80.67)/ml vs. (58.50±26.15)/ml) (P<0.05).

Conclusions： FSH and SCF by injecting muscle can improve the spermatogenesis recovery of Wistar rat with non-obstructive azoospermia.

Key words：Non-obstructive azoospermia model；FSH；Stem cell factor；Spermatogenesis

【作者简介】曹宇，男，湖南长沙人，硕士研究生，主治医师，泌尿外科和男性不育专业.(*通讯作者，Email：scottqiucn@126.com)

【基金项目】国家自然基金项目(30760250)

【收稿日期】2015-04-10；【修回日期】2015-06-20

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.011