卵母细胞成熟率与ICSI临床结局的关系分析

刘辉，吴克良，赵海滨，李梅，李城，于官令

(山东大学附属生殖医院，济南　250021)



卵母细胞成熟率与ICSI临床结局的关系分析

刘辉，吴克良*，赵海滨，李梅，李城，于官令

(山东大学附属生殖医院，济南250021)

【摘要】目的探讨卵母细胞成熟率与卵胞浆内单精子注射(ICSI)临床结局的关系。方法回顾性分析2014 年1～12月在本中心接受ICSI治疗且获卵数≥5枚、卵母细胞成熟率≥30%的2 196个周期，根据卵母细胞成熟率不同，分为5 组：A组：30%≤卵母细胞成熟率<60%；B组：60%≤卵母细胞成熟率<70%；C组：70%≤卵母细胞成熟率<80%；D组：80%≤卵母细胞成熟率<90%；E组：卵母细胞成熟率≥90%。比较5组间的受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、放弃周期率及临床妊娠率等。结果(1)各组基本资料比较，无显著性差异(P>0.05)；(2)受精率：A组(71.11%)显著低于C组(75.38%)、D组(77.40%)和E组(79.66%)，且 E组显著高于其他4组(P<0.05)；(3)卵裂率：A组(97.93%)显著低于D组(99.06%)和E组(99.13%)(P<0.05)；(4)周期取消率：A组(12.20%)显著高于C组(5.61%)、D组(3.57%)和E组(3.07%)，B组(8.02%)显著高于D组和E组，C组显著高于E组(P均<0.05)；(5)胚胎种植率：A组(36.71%)显著低于D组(48.80%)(P<0.05)；(6)其余观察指标各组间比较均无显著性差异(P>0.05)。结论卵母细胞成熟率较低时ICSI助孕的临床结局相对较差。卵母细胞成熟率低于70%时临床妊娠率开始下降，当卵母细胞成熟率低于60%时临床妊娠率进一步降低。

【关键词】卵胞浆内单精子注射；卵母细胞成熟率；临床结局

(JReprodMed2016，25(2)：129-134)

控制性超促排卵(COH)可以使患者在同一周期产生多个卵母细胞，但普遍存在着卵母细胞发育不同步的现象[1]。当不成熟卵母细胞占的比例较多时，其ICSI助孕结局是否存在差异，为探讨二者之间的关系，本研究分别对不同卵母细胞成熟率的卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕结局进行比较。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾分析2014年1～12月在本院接受ICSI 治疗且获卵数≥5枚的患者2 196个周期，为了尽量减少一些特殊患者对试验结果的影响，将卵母细胞成熟率严重低下(成熟率<30%的患者)可能为卵母细胞成熟障碍的患者排除本试验。本试验中所使用精子来源均为手淫取精或者附睾/睾丸穿刺。根据卵母细胞的成熟率(成熟卵母细胞数/获卵数)不同，分为 5 组：A组：30%≤卵母细胞成熟率<60%；B组：60%≤卵母细胞成熟率<70%；C组：70%≤卵母细胞成熟率<80%；D组：80%≤卵母细胞成熟率<90%；E组：90%≤卵母细胞成熟率。

二、研究方法

1. 促排卵方案：本试验所选择的患者均采用长方案，从黄体中期开始每日皮下注射短效GnRH-a(达必佳，0.1 mg/支，辉凌药业，德国)0.05～0.1 mg直至HCG日，14～18 d后垂体达到降调节时[LH<5 U/L，E2<50 pg/ml(183 pmol/L)，内膜<4～5 mm，无功能性囊肿]，根据患者年龄、基础FSH、LH水平、基础窦卵泡数及体重等因素，开始使用一定剂量的外源性促性腺激素(Gn)，包括r-FSH(果纳芬，默克雪兰诺，德国，或普丽康，默沙东，荷兰)和/或HMG(珠海丽珠制药)行促排卵治疗，根据阴道超声监测的卵泡发育情况及血清性激素水平调整Gn用量，当主导卵泡直径>20 mm或3个主导卵泡直径≥18 mm时，给予人绒毛膜促性腺激素(HCG)(珠海丽珠制药)4 000～8 000 U诱发排卵，HCG后36 h行B超引导下经阴道穿刺取卵术。

2. ICSI操作：将获得的卵母细胞体外培养3～6 h，在透明质酸酶(hyaluronidase，80 U/ml)中将卵母细胞周围的卵丘细胞脱去，然后将卵母细胞在显微操作仪下进行ICSI 操作，注射16～20 h后观察受精情况，在第2天(D2)、D3、D5、D6分别观察胚胎发育情况。

3. 胚胎评分：参考Puissant的早期胚胎评分标准：(1)4分：卵裂球形态大小正常均一，无核碎片；(2)3分：卵裂球形态大小轻微不均，无核碎片或核碎片<细胞团块的1/3；(3)2分：卵裂球大小不均，碎片介于细胞团块的1/3～1/2；(4)1分：只有1或2个卵裂球，大量无核碎片；(5)0分：卵裂球退化，完全是碎片。优质胚胎是指由正常受精卵发育而来，且符合以下条件：(1)D2观察到3～5个卵裂球，卵裂球没有多核，评分3～4分的胚胎；(2)D3观察到7～10个卵裂球，卵裂球没有多核，评分3～4分的胚胎[2]。

4. 胚胎移植：根据患者的激素水平和子宫内膜情况决定是否新鲜周期移植，本试验中所有的移植周期均为D3移植；周期取消的因素主要包括：卵母细胞全部未受精周期、全部为异常受精胚胎周期、受精卵全部未分裂周期、D3胚胎较差继续培养后既无可移植胚胎又无可冷冻胚胎周期。

5. 随访：胚胎移植后给予黄体酮行常规黄体支持，2周后检测血清HCG水平，确定是否妊娠，HCG阳性者为生化妊娠；移植后4～5周行B超检查，见孕囊及原始心管搏动者诊断为临床妊娠。

三、统计学处理

结果

一、各组患者一般资料、促排及胚胎移植情况比较

各组间平均年龄、平均助孕次数以及精子来源比较均无统计学差异(P>0.05)。各组间平均获卵数比较亦无显著性差异(P>0.05)；随着卵母细胞成熟率的降低受精率逐步降低，A组低于C组(P<0.05)，A组显著低于D组、E组(P<0.01)，E组显著高于B组、C组、D组(P<0.01)；A组的卵裂率低于D组和E组(P<0.05)；优质胚胎率各组间比较无显著性差异(P>0.05)；随着卵母细胞成熟率的降低周期取消率逐步升高，A组高于C组(P<0.05)，A组显著高于D组、E组(P<0.01)，B组高于D组(P<0.05)，B组显著高于E组(P<0.01)，C组高于E组(P<0.05)(表1)。

表1　各组患者一般资料、促排及胚胎移植情况比较 [(x-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05，**P<0.01；与B组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与C组比较，#P<0.05；与E组比较，▲P<0.01

二、各组行D3鲜胚移植周期的各项参数比较

对各组行新鲜胚胎移植的周期进行统计学分析，比较其一般资料、胚胎移植及妊娠结局情况，结果显示：各组间的平均年龄、平均助孕次数、平均获卵数、平均移植胚胎数和移植优质胚胎率比较，均无统计学差异(P>0.05)；A组和B组的临床妊娠率有低于C组、D组、E组的趋势，但无统计学差异(P>0.05)；A组和B组的胚胎种植率也略低于C组、D组、E组，其中A组与D组比较有统计学差异(P<0.05)(表2)。

表2　各组行鲜胚移植周期的参数比较[(x-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05

讨论

随着辅助生殖技术的不断发展，卵母细胞成熟率成为衡量促排卵效果的一项重要指标，越来越受到生殖领域医生的重视。Bar-Ami等[3]的研究发现，当不成熟卵母细胞率>25%时，受精率和临床妊娠率就会明显下降，本研究结果与其发现基本一致。本文通过各组间临床结局的对比发现，随着卵母细胞成熟率的下降，受精率和优质胚胎率都随之下降，尤其是受精率的下降极其明显，而且当卵母细胞成熟率低于60%时，卵裂率也会随之下降，这与王锦凤等[4]的研究结果相似；且周期取消率也随着卵母细胞成熟率的降低出现较为显著的增加。当卵母细胞成熟率低于70%时临床妊娠率开始下降，卵母细胞成熟低于60%时临床妊娠率明显降低。因此，我们应该高度重视低卵母细胞成熟率与ICSI助孕治疗临床结局之间的关系，尽可能地提高ICSI周期中的卵母细胞成熟率，以期获得较好的临床结局。

COH是整个辅助生殖过程中尤为重要的一个环节，促排卵效果的好坏直接影响所获得卵母细胞的质量，进而影响整个助孕治疗的临床结局。COH包括卵泡的募集、发育、排卵的过程，其过程通常是不完全同步的，只有克服不同步的因素才有可能获得质量与自然周期主导卵泡一样的优质卵母细胞[5]。本研究中，卵母细胞成熟率较低的组别很可能是因为其COH方案不太理想，导致了大量的卵泡发育不同步，从而影响了卵母细胞质量、受精率、卵裂率和最终的临床结局。

人类卵巢中存在成熟与未成熟阶段的卵母细胞，绝大多数卵母细胞处于GV期。在激素等促排卵因素的刺激下，生发泡破裂(GVBD)，第一极体(Pb1)排出，进入MⅡ期，成为成熟卵母细胞。从GV期到MⅡ期的过程即“卵母细胞成熟”。卵母细胞成熟经历了核成熟和细胞质成熟，这其中包括了一系列复杂、有序的细胞核与细胞质事件。核成熟包括生发泡破裂和减数分裂，染色体组装到纺锤体上并向细胞外周移动，完成第1次减数分裂，被少量细胞质包围的一套同源染色体作为Pb1排出，另一套遗传物质则留在细胞质中并进入第2次减数分裂中期，卵母细胞从卵泡中排出。细胞质成熟则涉及到细胞器重组、Ca2+储备增加、抗氧化剂升高、mRNA和蛋白质贮存等诸多事件[6]，且细胞质的成熟度与后续的胚胎发育密切相关。通常所说的卵母细胞成熟一般是指核成熟，但在COH过程中，外源性的Gn可导致卵母细胞代谢异常、三磷酸腺苷(ATP)含量下降、转录异常、不同步的核/质成熟[7]。只有胞浆成熟的卵母细胞才能实现卵裂球发育的同步化，促进胚胎发育，成为优质胚胎[8-10]。因此，低卵母细胞成熟率周期中成熟卵母细胞的受精率和优胚率都比较低，极有可能是由于细胞核与细胞质的不同步导致的。

卵母细胞成熟率低分为两种情况，偶然产生的不成熟卵母细胞和反复发生的卵母细胞成熟障碍，卵母细胞成熟障碍特指获得的卵母细胞中大部分为不成熟卵，卵母细胞成熟障碍有时甚至是完全性的，即无成熟卵母细胞产生。目前，对于完全的卵母细胞成熟障碍患者，接受供卵是唯一的治疗途径[11]。本研究中将卵母细胞成熟率低于30%的患者排除，以避免对试验结局的影响。临床上，大多数的低卵母细胞成熟率现象都是偶然产生的，若能够找出影响卵母细胞成熟率的因素，即可以对ICSI中卵母细胞的成熟率进行改善。于康等[12]的研究发现，卵泡液中适量的雌激素(E2)和孕酮(P)可以促进卵母细胞的成熟，当卵泡液中10≤P/E2≤30时卵母细胞成熟率最高。Raziel等[13]的研究认为对COH过程中既往未成熟卵较多的患者，适当延长HCG注射至取卵的时间对提高胚胎质量和妊娠率有一定帮助；陈媛媛等[14]的研究亦发现，HCG注射后取卵时间对卵母细胞成熟率有一定影响，注射HCG后35.0～35.5 h取卵，获得卵母细胞的成熟率将显著低于HCG后35.6～36.5 h取卵的患者；还有研究者认为：体外培养时，自体颗粒细胞的存在对于卵母细胞的成熟是有利的[15]，宫立国等[16]的研究发现，延迟ICSI操作中脱去颗粒细胞的时间可以提高卵母细胞的成熟率，但是其差异不显著；李轶等[17]的研究发现，成熟卵泡比例与注射HCG的时机对卵母细胞的成熟率有影响，当HCG日成熟卵泡(≥18 mm)比例≤20%时，其卵母细胞成熟率显著低于成熟卵泡比例>20%的患者。因此，在辅助生殖过程中众多因素都可能影响到卵母细胞的成熟率问题。

在COH过程中，应该高度重视低卵母细胞成熟率对临床结局的影响，通过对既往病史的分析和血清激素水平的测定，把握好Gn用量以及HCG注射时机，及时调整临床用药方案[18]，尽量减少低卵母细胞成熟率的发生，对获得发育同步的高质量卵母细胞，进而获得较好的临床结局尤为重要。而在获卵过程中，可以通过对卵丘复合物观察，当发现卵母细胞可能存在成熟率较低时，适当延迟脱颗粒的时间可能有助于最后的助孕结局。有动物实验研究显示，5%O2环境比20%O2更有利于未成熟卵体外成熟和胚胎发育[19]，提示可以通过将卵丘复合物放入低氧环境中培养以期获得更高的卵母细胞成熟率。体内成熟卵母细胞排卵后至到达输卵管壶腹部开始受精，期间所经历的时间大约为4～6 h，即正常的受精时间应该是卵母细胞成熟后的4～6 h，而卵母细胞成熟率较低的患者可能是由于部分卵母细胞还不具备受精能力，导致受精率的下降，因此可能可以通过推迟ICSI受精时间来提高受精率；而对于已经出现的卵母细胞成熟率极低的情况，可以将未成熟的卵母细胞通过体外培养技术(IVM)联合ICSI的方式获得胚胎，也许可以获得较好的累积妊娠率。

综上所述，卵母细胞成熟率较低时ICSI助孕结局相对较差，卵母细胞成熟率低于70%时临床妊娠率开始下降，当卵母细胞成熟率低于60%时临床妊娠率进一步降低。因此，临床上应对ICSI周期中的低卵母细胞成熟率情况引起高度重视，并综合评估各方面情况以采取积极措施予以调整，以期改善其临床结局。

【参考文献】类型标识：根据GB3469规定，在文题后标识参考文献类型。专著[M]，论文集[C]，报纸文章[N]，期刊文章[J]，网络期刊文章[J/OL],学位论文[D]，报告[R]，标准[S]，专利[P]。对于专著、论文集中析出文献，采用字母[A]；其他未说明的文献采用[Z]。

[1]郑屹，张欢，林佳，等. 两侧卵巢获卵数差异率与体外受精-胚胎移植结局的关系 [J]. 生殖医学杂志，2015，24：26-31.

[2]Puissant F，Van Rysselberge M，Barlow P，et al. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment [J]. Hum Reprod，1987，2：705-708.

[3]Bar-Ami S，Zlotkin E，Brandes JM，et al. Failure of meiotic competence in human oocytes [J]. Biol Reprod，1994，50：1100-1107.

[4]王锦凤，肖露，钱卫平，等. 发育不同步且未行穿刺的大卵泡在取卵日有无卵母细胞对IVF-ET结局的影响 [J]. 生殖医学杂志，2015，24：520-524.

[5]庄广伦. 高质量卵子从何谈起 [J]. 生殖医学杂志，2011，20：81-82.

[6]汤江静，尹萍，邵敬於，等. 卵子线粒体老化——辅助生殖技术面临的瓶颈 [J]. 生殖与避孕，2013，33：255-260.

[7]张媛媛，向卉芬，谢鑫，等. 卵胞质内单精子显微注射后异常受精的影响因素分析 [J]. 生殖与避孕，2012，32：814-818.

[8]Wang LY，Wang DH，Zou XY，et al.Mitochondrial functions on oocytes and preimplantation embryos [J]. J Zhejiang Univ Sci B，2009，10：483-492.

[9]Hsieh RH，Au HK，Yeh TS，et al.Decreased expression of mitochondrial genes in human unfertilized oocytes and arrested embryos [J]. Fertil Steril，2004，81(Suppl 1)：912-918.

[10]孔令红，刘忠，李红，等. 自体颗粒细胞线粒体移植对胚胎发育质量的影响 [J]. 中华妇产科杂志，2004，39：105-107.

[11]王俊超. 卵子成熟障碍综合征的特征及分子机制 [J]. 生殖与避孕，2014，34：778-782.

[12]于康，王晓燕，张玉，等. 卵泡液中血管内皮生长子和甾体激素水平对卵母细胞成熟和受精的影响 [J].生殖医学杂志，2011，20：18-22.

[13]Raziel A，Schachter M，Strassburger D，et al.In vivo maturation of oocytes by extending the interval between human chorionic gonadotropin administration and oocyte retrieval [J]. Fertil Steril，2006，86：583-587.

[14]陈媛媛，刘兰兰，蔡嘉力，等. 人绒毛膜促性腺激素注射后取卵时间对卵子及胚胎质量的影响 [J]. 临床军医杂志，2014，42：721-725.

[15]Johnson JE，Higdon HL，Boone WR，et al. Effect of human granulosa cell co-culture using standard culture media on the maturation and fertilization potential of immature human oocytes [J]. Fertil Steril，2008，90：1674-1679.

[16]宫立国，王维华，Inderbir Gill. ICSI操作中拆卵时间对胚胎质量及妊娠结局的影响 [J]. 中国优生与遗传杂志，2011，19：113-114.

[17]李轶，李瑞岐，区颂邦，等. 成熟卵泡比例与注射时机的选择及对卵子发育潜能的影响 [J]. 中山大学学报(医学科学版)，2014，35：552-558.

[18]方小武，吴日然，徐建亚，等. 常规IVF受精失败或受精低下相关因素分析 [J]. 中国优生与遗传杂志，2012，20：112-113.

[19]Pereira MM，Machado MA，Costa FQ，et al. Effect of oxygen tension and serum during IVM on developmental competence of bovine oocytes [J]. Reprod Fertil，2010，22：1074-1082.

[编辑：谷炤]

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例：[1]来可如，陈湫波.金塑混合环等三种宫内节育器比较性研究[J].生殖与避孕，1991，11：46-54.

[2]Wetzeis A， Baotiaans BA, Goverde HJM, et al. Vero cells stimulate lumen sperm motaliy in vitro[J]. Fertil Steril,1991,56:535-539.

书籍：主编者.(或作者.文题[A].见：主编者)书名[M].版次.卷次.出版地：出版者，年份：起页-止页.

例：[1]王淑贞 主编.妇产科理论与实践[M].上海：科学技术出版社，1981：68-79.

[2]Samsioe GN, Mattsson LA. Regimens for today and the future[A]. In:Rogerio AL(ed). Treatment of the post-menopausal woman[M]. New York:Raven Press,1994：373-383.

本刊编辑部

Relationship between oocyte maturation rate and clinical outcome of ICSI

LIUHui，WUKe-liang*，ZHAOHai-bin，LIMei，LICheng，YUGuan-ling

ReproductionHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250021

【Abstract】

Objective： To explore the relationship between oocyte maturation rate and clinical outcome of ICSI.

Methods： A total of 2 196 infertile patients undergone ICSI treatment，whose number of oocytes retrieved≥5 and maturation oocyte rate≥30% in our IVF center from Jan. 2014 to Dec. 2014 were included in this study.The patients were divided into five groups according to different oocyte maturation rate：group A with≥30% &<60%，group B with≥60% &<70%，group C with≥70% &<80%，group D with≥80% &<90%，group E with≥90%. The clinical outcomes including fertilization rate，cleavage rate，good quality embryo rate，implantation rate，cancellation cycle rate，and clinical pregnancy rate were compared among the five groups.

Results： There were no differences in basic information among the five groups (P>0.05). The fertilization rate of group A (71.11%) was significantly lower than that of group C (75.38%)，group D (77.40%) and group E (79.66%)，and group E was very significantly higher than the other four groups (P<0.05). The cleavage rate of group A (97.93%) was significantly lower than that of group D (99.06%) or group E (99.13%) (P<0.05). The cancellation cycle rate of group A (12.20%) was significantly higher than that of group C (5.61%)，group D (3.57%) and group E (3.07%) (P<0.01). The cancellation cycle rate of group B (8.02%) was significantly higher than that of group D and E (P<0.05)，and group C was significantly higher than group E (P<0.05). The implantation rate of group A (36.71%) were significantly lower than group D (48.80%)(P<0.05). There were no statistical differences in other clinical outcomes among five groups (P>0.05).

Conclusions： Clinical outcome of ICSI would be affected by low oocyte maturation rate. The clinical pregnancy rate start to decrease when the oocyte maturation rate is less than 70%，and the clinical pregnancy rate further decrease when the oocyte maturation rate is less than 60%.

Key words：ICSI；Oocyte maturation rate；Clinical outcomes

【作者简介】刘辉，男，山东人，硕士，实验师，生殖医学专业.(*通讯作者)

【基金项目】卫生公益性行业科研专项(201402004)

【收稿日期】2015-08-17；【修回日期】2015-09-21

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.005