贵州核桃枝枯病病原菌的初步鉴定

吴跃开 余金勇 朱秀娥

(贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)

贵州核桃枝枯病病原菌的初步鉴定

吴跃开 余金勇 朱秀娥

(贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)

在贵州省龙里县某核桃种植基地，近几年来枝枯病一直严重发生危害，病原菌主要侵染梢、枝甚至主干，导致枝梢枯萎甚至全株死亡。通过一系列的实验研究，包括病菌的分离培养、致病性接种、形态特征观测以及rDNA-ITS序列分析，证实引起该病的病原菌为越橘间座壳(DiaporthevacciniiShear)。由该菌引起的核桃枝枯病在国内外系首次报道。

核桃；枝枯病；病原菌；越橘间座壳

核桃是十分重要的经济果树，目前在我国20多个省市都有大面积栽培，种植数量和产量均居世界首位。随着国内外核桃需求量的不断增加，核桃产业必将成为我国许多农村地区脱贫致富的重要产业。贵州是我国核桃主产区之一，得天独厚的自然条件为核桃产业的发展提供了十分广阔的空间，省委、省政府高度重视核桃产业发展，出台了《贵州省核桃产业化扶贫建设规划(2011～2015年)》，提出到2018年发展100万公顷核桃的战略目标。

然而，核桃病虫害的发生,危害正成为我省核桃产业持续健康发展的重大制约因素。其中，核桃枝枯病是一种十分严重的病害种类，它的发生常常导致大量中幼龄核桃树的枝条枯死甚至全株死亡，不但造成了极大的经济损失，同时还严重影响了核桃种植户的积极性，有的甚至已经计划改种其它作物。为了掌握该病的确切病因，从而采取有针对性的防治措施，我们对该病的病原学进行了初步研究。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病害调查

所调查核桃种植基地位于贵州省龙里县摆省乡，面积约7公顷多，所栽核桃均为嫁接苗(接穗来源地不明)。病害调查内容主要包括枝枯病的发病时间、发病症状、受害株率、危害程度、为害后果等。

1.2 病害采样及分离培养

采集具有典型症状的当年病枝，送回实验室进行研究。对采集到的病害标本尽快实施病菌分离操作，分离部位包括病健交界处组织、病部中间组织以及病菌子实体(分生孢子座)。分离前将病枝用自来水冲洗干净，再用75%乙醇擦洗消毒，然后用消毒的刀片切开，用接种针挑取相应的病部组织迅速转入试管，在28 ℃恒温条件下进行培养。分离培养基为PDA培养基。分离培养出的培养物各通过2次转管进行纯化，最终所获培养物(菌株)按采集地点、采集时间及标本号进行统一编号，于4℃冰箱内保存备用。

1.3 致病性接种试验

往纯化的试管菌种中加入无菌水并搅匀以制成孢子悬浮液。供试核桃树苗选用健康无病的2年生容器嫁接苗，一共20株，分成4组，分别进行不同处理：①在接种前用刀片轻轻刮伤茎皮，然后涂抹菌液；②不作刮伤处理，直接涂抹菌液(对照1)；③刮伤处理，然后涂抹无菌水；④不作刮伤处理，直接涂抹无菌水(对照2)。将各试验苗露天摆放，但各处理的苗木要保持相隔一段距离(避免交叉感染)。试验期间室外气温20～32℃，相对湿度>90%。一周后观察发病情况。

1.4 病原菌形态特征观测

对已经产生子实体的标本，可直接进行徒手切片，在显微镜下观测记录子实体结构、大小以及其中孢子的形态特征。对人工分离物进行镜检时，则包括菌落形态、生长速度、颜色，分生孢子形态、大小、颜色，产孢结构形态等特征。

1.5 分子生物学研究

所获得的纯培养菌落委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行ITS序列测定。依据ITS序列，采用MEGA4.0中的邻接法(neighbor-joining method)进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1000次可信度分析。

1.6 病原的分类鉴定。

根据病原菌的形态特征，结合分子生物学研究结果，参考相关文献资料，对病原物进行分类鉴定。

2 结果与分析

2.1 病害危害情况

2014年至2015年连续两年的调查结果表明，核桃枝枯病在所调查的核桃幼林中发生严重，其发病高峰期一般在4～5月间。通过实地调查，感病株率高达85%，其中受害程度为中、重度的占70%。受害植株的枝条大量枯死，少数全株死亡。

2.2 病症特点

病原菌可侵染核桃植株的任何部位，包括新发的嫩梢嫩叶、复叶柄、枝及主干，导致枝条枯死甚至全株死亡。侵染嫩梢、嫩叶时，梢、叶变黑干枯；侵染枝、干部位时，初期表现为一小型的暗色渍状斑，随后逐渐扩大，病部皮层颜色因此也变暗变黑，其下组织变黑腐烂并常向外渗水，有酒糟味(图1，A-C)。后期病部变黑干枯，其上着生许多黑色的颗粒状物(子座)，子座成熟时上部开裂，潮湿条件下还会通过裂口往外溢出淡黄色半透明的卷曲的分生孢子角(图2，A-C)。

值得一提的是，嫁接苗所用砧木一般不感病，表明本土实生苗对该菌具有显著的抗性。

2.3 病原形态特征

载孢体为真子座(分生孢子座)，埋生于皮层下，成熟后外露，其形状为球形、椭球形，常汇合成其它形状，单个平均直径为400～700μm(多数550～650μm)，器壁黑色有光泽，其内部组织溶解成不规则的迂回曲折的腔体(分生孢子腔)(图3-A)；腔内分生孢子梗较短，宽约1.2μm，长10～15μm(图3-B)。子座在后期会发生开裂，其裂口大，呈纺锤形、三角形、梯形等多种形状，潮湿条件下从中伸出浅黄透明的分生孢子角。

图1 核桃枝枯病野外发病症状 A-新梢感病枯死；B-主干感病；C-主干病部组织发生腐烂而变褐、变黑

图2 核桃枝枯病子实体 A-较老病枝上出现大量病菌子实体；B-子实体放大；C-从子实体溢出分生孢子角

图3 核桃枝枯病病原特征 A-子座纵剖面，示其内部发生溶解而形成不规则的分生孢子腔；B-分生孢子腔内的分生孢子梗；C-分生孢子梗及BETA型分生孢子。

PDA培养基上，菌落生长速度很快，平均每天生长10～12 mm。初白色，圆形，气生菌丝较疏松(不紧密)，边缘较薄。一周后，菌落直径可达58～60mm，同时会呈现不太显著的同心圆环(后期子座也大致于同心环上产生)(图4-A)。较老的菌落颜色往往变薄，呈灰色、灰黄色甚至暗黑色。子座7～10天后开始产生，至3～4周成熟。子座黑色，球形至不规则形，大，基部较宽，直径1.0～1.3mm，分散单生或多个汇合聚生(图4-B)，常见乳白色或乳黄色的分生孢子团从成熟的分生孢子器顶部的孔口溢出。分生孢子具两种类型，其中甲型(α型)分生孢子近圆柱形或近纺缍形、长椭圆形，单胞(胞内含双油滴)，无色，较直，两端钝圆，大小为2.2～2.5×6.0～7.5μm；乙型(β型)分生孢子线形，单胞无色，直或一端弯曲，大小为1.2～1.4×21.2～36.3μm。分生孢子梗短，顶部狭，有时呈梭形(图4-C)。

2.4 致病性测试结果

由于室外致病性接种试验期间的气温较高、湿度较大，人工接种后病菌发展很快，不论是刮伤接种还是未刮伤接种，一周后观察都可见接种部位呈现显著的渍状暗褐色病斑，其中刮伤接种组的病斑明显较大，色泽也较深呈黑色。相比之下，两个对照组均不发病。对接种后产生的病斑进行病菌的再分离培养，所获菌株与试验用菌株形态特征一致，符合柯赫氏法则。

2.5 DNA序列分析结果

利用Blast 软件，将引物ITS4测序结果获得的ITS片段序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关同属菌物构建进化树(见图 )。结果表明，待测菌种样品(HTZK1401)与Diaporthe vaccinii(Accession No.KC488258)聚成一支，同源度达99%(图5)。

2.6 病原菌的鉴定

α型及β型孢子的出现是拟茎点霉属真菌(Phomopsis)的独有特征，但该属的许多种在形态特征上均十分相似，常常无法通过形态特征予以区别。因而，依据高度保守的真菌rDNA ITS区序列的比较分析，可以作为这类真菌可靠的辅助鉴定手段。本研究根据病菌的侵染危害特点、形态学特征，结合ITS序列的测定与比对结果，参考相关的文献资料(Ramsdell 1995; Farr et all. 2002；OEPP/EPPO 2009)，初步确认引起核桃枝枯病的病原菌为越橘间座壳DiaporthevacciniiShear(无性型为乌饭树拟茎点霉PhomopsisvacciniiShear)。

不过，需要指出的是，本研究中病原菌的形态特征与相关文献资料的描述(包括分生孢子大小)存在一定的差异(Ramsdell 1995；Farr et all. 2002)，同时这些历史资料相互间对该菌的描述也不尽相同。这表明，由于生长条件(寄主、生长环境、培养基、培养条件等)的不同，病菌的形态特征会产生一定的差异。

图5 核桃枝枯病病原菌(HTZK1401)的系统发育树

到目前为止，无论是在野外，还是人工培养中，均未发现其子囊(有性)世代Diaporthe vaccinii Shear。根据相关文献资料的描述，其子囊壳直径为0.3～0.5×0.2～0.4mm，球形，近基部稍扁，具黑色的厚的多层壁, 成熟子囊壳具一长颈，突出于寄主表皮之上，子囊37～51×7～12μm, 长椭圆形，无柄, 顶部加厚并具一紧致的小孔。每一子囊含8个子囊孢子，子囊孢子大小8～12×2～3μm, 双胞具油滴，椭圆形，分隔处稍缢缩(Caruso & Ramsdell 1995)。

3 结论与讨论

此前，文献记载危害核桃树的拟茎点霉属真菌有P.elaeagni(Green, R. J. Jr, 1977)以及P.juglandina(孙俊，2013)而由PhomopsisvacciniiShear引起的核桃枝枯病在国内外均系首次报道。

P.vacciniiShear及其有性型D.vacciniiShear 原产北美，最初在杜鹃花科越桔属植物大果越桔(Vacciniummacrocarpon)及红莓苔子(V.oxycoccosL.)上发现并被描述(Shear et al., 1931)，在美国及加拿大的越桔属植物种植区广泛分布(Shear et al. 1931; Weingartner & Klos 1975; Chao & Glawe 1985; Farr et al. 2002; Tadych et al. 2012)。这一病原菌一直被认为具有较强的寄主专一性(即专门为害越桔属植物)，危害寄主植物的枝干、梢、叶及果实，导致溃疡病、梢枯、枝枯、果腐(Chao & Glawe 1985；OEPP/EPPO 2009)，因而是这类植物的重要病原菌之一，检疫意义十分重大。目前，该病菌已经传入到北美以外的其它许多国家与地区，包括南美的智利 (Chao & Glawe 1985; Weingartner& Klos 1975)以及欧洲的罗马尼亚(Teodorescu et al.1985)、英国(Wilcox & Falconer 1961; Baker 1972)、立陶宛(Gabler et al. 2004; Kaĉergius et al. 2004)、拉脱维亚以及荷兰(Lombard et al.2014)等。

由D.vaccinii引起的核桃枝枯病应当引起我们的极大关注。首先，传统上认为该病原菌寄主专一性强，专门为害越桔属植物，我们的研究首次证明其能够寄生危害其它科属的寄主植物，并造成严重的危害后果。这表明，随着环境的改变，某些传统上认为的专一性病原菌也可能会侵染传统寄主之外的其它植物。对此的解释是，D.vaccinii本身可能具有较高的种内遗传多样性，这一假设有待我们进一步深入研究。其次，由于近年来越桔属经济植物(尤其是蓝莓)在国内(包括贵州省)的种植面积在不断扩大，该病菌蔓延扩散危害的潜在可能性极大，这一点应引起有关部门的高度重视。第三，鉴于该病的侵染性极强，造成的潜在危险性极大，当务之急是对其生物学特性、发生发展规律及相应的防治措施进行深入的试验研究。

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Identification of the Causal Agent of Branch Blight Disease of Walnut Trees in Guizhou

WU Yue-kai YU Jin-yong, ZHU Xiu-e

(Guizhou Academy of Forestry, Guiyang, Guizhou,550005)

In a walnut plantation located in Longli county of Guizhou province, the walnut trees suffered serious branch blight disease. The causal agent mainly invade the leaves, shoots, branches, and even the stems, resulting in the wilting of the branch or even the death of whole tree. In order to identify the causal agent, a series of studies were carried out including the isolation, cultivation, pathogenicity test, morphological observation, as well as the rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the causal agent of the walnut branch blight isDiaporthevacciniiShear. This is the first report of this fungus as the causal agent of walnut branch blight disease.

walnut; branch blight disease; causal agent;DiaporthevacciniiShear

2016-03-10

吴跃开(1972 ～ )，男(侗族)，贵州黎平人，副研究员，主要从事植物保护及有益生物开发利用研究。

贵州省科技厅重大专项课题“贵州省核桃产业化关键技术研究与示范”(黔科合重大专项字[2011]6011 号)

S763.102

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