急性脑梗死患者miR-210的表达及意义

吴　皎　姜　新　陈晓红

辽宁省人民医院神经内科　沈阳　110016



急性脑梗死患者miR-210的表达及意义

吴皎姜新陈晓红

辽宁省人民医院神经内科沈阳110016

【摘要】目的探讨急性脑梗死(ACI)患者血清中缺氧激活因子微小RNA-210(miR-210)的表达情况及临床意义。方法选取2013-01—2015-01在我院治疗的ACI患者122例(ACI组)，同时选择同期健康体检人群80例为对照组，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清miR-210表达水平。结果ACI组miR-210表达量为(1.24±0.07)2-△△Ct，明显低于对照组的(2.02±0.11)2-△△Ct，差异有统计学意义(P<0.05)；男女ACI患者血清miR-210表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；≤60岁和>60岁ACI患者血清miR-210表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；重度ACI患者血清miR-210表达为(1.10±0.08)2-△△Ct，明显低于轻度和中度患者，差异有统计学意义(P<0.05)；中度ACI患者血清miR-210表达为(1.29±0.10)2-△△Ct，低于轻度患者，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-210对ACI的ROC曲线下面积为0.961，95% CI为0.926～0.996，截断值为(1.378)2-△△Ct，时，灵敏度为91.30%，特异度为97.54%。结论急性脑梗死患者血清中miR-210表达减弱，且与急性脑梗死严重程度有关，可作为急性脑梗死的诊断依据。

【关键词】急性脑梗死；miR-210；诊断价值；疾病程度

随着社会的不断发展，人们生活方式及饮食习惯均发生较大改变，且社会老龄化趋势明显，故高血压、高血脂以及糖尿病患者日益增多，加之当前快节奏生活使其渐渐忽视自己身体健康，运动量下降甚至不运动，同时部分人嗜烟好酒及喜“三高”食品，故造成急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)的发病率不断提高。ACI发病突然性高，病情发展速度快，具有较高病死率，即使患者被抢救成功，均会造成瘫痪、脑神经损伤、语言及肢体功能障碍等后遗症，致残率极高[1]。有报道称[2-3]，血清中缺氧激活因子微小RNA-210(miR-210)的表达水平和急性脑梗死的形成以及发展具有相关性，本文探讨其具体关系，报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取2013-01—2015-01在我院治疗的急性脑梗死(ACI)患者，纳入标准：(1)诊断符合《中国急性缺血性卒中诊治指南2010》中的标准[4]；(2)均经头颅CT或MRI证实；(3)均为发病48 h内住院治疗；(4)患者及家属知情同意，并签署同意书。排除标准：合并其他肿瘤、免疫系统疾病者。本次研究共纳入患者122例(ACI组)，根据美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS)评分标准，<5分为轻度，5～20分为中度，>20分为重度，其中轻度36例，中度55例，重度31例。同时选择同期健康体检人群80例为对照组，2组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　2组一般资料比较

1.2血样采集患者于脑梗死3 d后分别抽取空腹静脉血3～4 mL滴入抗凝试管，静置30～35 min，用3 200 r/min离心5 min，取上清液滴入干净试管，于-80 ℃条件下冷藏备用。

1.3RNA提取方法将分离上清溶液滴加1 mL Trizol试剂进行充分裂解[5]，于5 min后加200 μL氯仿，于4 ℃下取12 000 r/min进行离心15 min，后加入500 μL异丙醇，室温放置20 min，4 ℃下11 000 r/min离心20 min，将上清弃，加75%的乙醇1 mL后用漩涡器进行震荡以混均，再次于4 ℃下12 000 r/min进行离心15 min后保存备用。

1.4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miRNA反转录总反应体系为30 μL，包括[6]RNA=1 μL×250 ng/1 μL、4种核糖三磷酸溶液=2 μL、无 RNA 酶双蒸水=20 μL、反应引物=2 μL、上样缓冲液(10×)=3 μL、RNA反应抑制酶=0.5 μL、RNA反转录酶1.5 μL。15 ℃下反应30 min、45 ℃下反应30 min、85 ℃下反应5 min，于4 ℃保存。

荧光定量 PCR总反应体积22 μL，包括cDNA 稀释液= 3 μL、SYBR荧光混合液(2×)=12 μL、上游引物=1 μL、下游引物=1 μL、ddH2O= 5 μL。95 ℃反应 30 s、60 ℃反应30 s，循环35次后72 ℃下反应5 min，于4 ℃保存。通过仪器测定PCR荧光强度，使用2-ΔΔCt法计算miR-210基因相对表达。

2结果

2.12组血清miR-210表达情况ACI组miR-210表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别n血清miR210表达(2-△△Ct)t值P值ACI组1221.24±0.07对照组802.02±0.11-61.611<0.05

2.2血清miR-210表达与患者年龄、性别关系男女ACI患者血清miR-210表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；≤60岁和>60岁ACI患者血清miR-210表达差异比较无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　不同年龄、性别患者血清miR-210

2.3不同程度梗死患者血清miR-210表达情况重度ACI患者血清miR-210表达明显低于轻度和中度患者，差异有统计学意义(P<0.05)；中度ACI患者血清miR-210表达低于轻度患者，差异有统计学意义(P<0.05)。随梗死程度的加重，患者miR-210表达呈降低趋势。见表4。

表4　不同程度梗死患者血清miR-210

2.4血清miR-210对ACI的诊断价值采用ROC曲线分析miR-210对ACI的诊断价值，结果显示ROC曲线下面积为0.961，95%CI为0.926～0.996，截断值为(1.378)2-△△Ct，灵敏度为91.30%，特异度为97.54%。见图1。

图1　血清miR-210诊断ACI的ROC曲线

3讨论

现代医学已证实，ACI发病机制为人大脑血管闭塞所致脑组织供血及供氧不足，从而导致一系列的炎症、脑细胞凋亡及脑组织损伤和脑血管再生障碍等病理性异变[7]。ACI患者多伴神经功能障碍，残疾率较高。既往研究显示[8]，人细胞内miRNA表达水平和供血及供氧具有密切相关性，尤其低血氧可明显导致miRNA变化。文献报道，绝大多数miRNA能明显影响人体血及氧供应，并可调节组织再灌注损伤过程中细胞凋亡过程。有研究认为，当人大脑处于较严重缺血状态时，miRNA表达将会呈现上升，这可能和其具有促进新血管生成机制相关。也有动物实验证明[9]，鼠全脑处于缺血及再灌注损伤时，其海马miR-210和miR-21会呈现明显变化。本研究中，ACI组患者miR-210表达量明显低于对照组(P<0.05)，证明人脑出现损伤时，其血液中miR-210也会出现变化，且和脑损伤具有负相关性。这可能是因miR-210可被低氧诱导因子诱导，当ACI患者大脑血管阻塞时，脑组织处于低氧状态，miR-210表达量需呈现下降方可在低氧状态下暴露，已被低氧诱导因子辨识后诱导转录。研究显示，miR-210在低氧状态下细胞调控过程中具有重要意义，其在脑组织及脑血管血液中均有表达。

目前研究还显示，miRNA可通过调控细胞凋亡因子及增殖因子表达水平，能够影响细胞生长周期，促进新生细胞生成，尤其可致血管内皮细胞在短时间快速增殖以修复脑血管损伤，且miRNA和炎症反应间具有相互促进作用，启动炎症“瀑布”信号表征。研究显示[10]，miR-210在正常人血液内表达水平稳定，其异常表达变化对人体疾病及损伤反应具有较强敏感性。同时，miR-210检测方法较简便，仅需抽取患者静脉血做常规RNA提取便可，故其已被广泛应用于多种癌症及危重型疾病诊断中。本研究中，重度ACI患者血清miR-210表达明显低于轻度和中度患者(P<0.05)，中度ACI患者血清miR-210表达低于轻度患者(P<0.05)。说明随梗死程度的加重，患者miR-210表达呈降低趋势，也证明脑梗死作为一种重度炎症反应，其病情的严重程度可被miR-210明显表达。本研究中，miR-210对ACI诊断的ROC曲线下面积为0.961，灵敏度91.30%，特异度97.54%，证明miR-210表达水平对于ACI诊断及治疗预后具有较为重要的指导意义。

值得注意的是，本研究中男女ACI患者血清miR-210表达比较差异无统计学意义；60岁以上和以下ACI患者血清miR-210表达比较差异也无统计学意义，这表明miR-210表达水平与患者的年龄和性别无相关性，证明其作为一种常规标识检测指标以诊断及判断ACI治疗结果的可行性。

4参考文献

[1]赵菁，高波. 微小RNA-210在急性脑梗死中的表达及意义[J].中华危重病急救医学，2014，26(12)：910-913.

[2]Zhou J，Zhang J. Identification of miRNA-21 and miRNA-24 in plasma as potential early stage markers of acute cerebral infarction [J]. Mol Med Rep，2014，10(2)：971-976.

[3]Zeng L,Liu J,Wang Y,et al.Micro RNA-210 as a novel blood biomarker in acute cerebral ischemia[J].Front Biosci,2011,3：1 265-1 272.

[4]刘鸣，张苏明，郝子龙.中国急性缺血性卒中诊治指南2010版的制定及解读[J].中华神经科杂志，2011，44(6)：369-374.

[5]Lou YL，Guo F，Liu F，et al. miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia[J]. Mol Cell Biochem，2012，370(2)：45-51.

[6]Lopez-Ramirez MA，Wu D，Pryce G，et al. MicroRNA-155 negatively affects blood-brain barrier function during neuroinflammation[J]. J FASEB，2014，28(6)：2 551-2 565.

[7]Hamilton DE，Cooke CL，Carter BS，et al. Basal microRNA expression patterns in reward circuitry of selectively bred high-responder and low-responder rats vary by brain region and genotype[J]. Physiol Genomics，2014，46(8)：290-301.

[8]Kim W，Lee Y，McKenna ND，et al. miR-126 contributes to Parkinson′s disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling[J]. Neurobiol Aging，2014，35(7)：1 712-1 721.

[9]闫丽娟. 酒依赖与正常对照大鼠脑组织miRNA-9表达差异性研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨医科大学，2014.

[10]杨淑娜，马爱军. 无症状性脑动脉粥样硬化与大动脉粥样硬化性卒中患者血浆微小RNA表达分析[J]. 中国卒中杂志，2015，10(2)：120-127.

(收稿2014-12-18)

The expression of miR-210 in patients with ACI and its significance

WuJiao，JiangXin，ChenXiaohong

DepartmentofNeurology，thePeople’sHospitalofLiaoningProvince，Shenyang110016，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of micro RNA-210 (miR-210) in acute cerebral infarction (ACI) patients serum and its clinical significance. Methods From Jan. 2013 to Jan. 2015，122 patients with ACI treated in our hospital (ACI group) were selected，at the same time，80 healthy people were selected as the control group，the serum miR-210 expression level was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The ACI group mir-210 expression amount(1.24±0.07)2-△△Ct，was significantly lower than that in control group (2.02±0.11)2-△△Ct，the difference was statistically significant (P<0.05)； Male and female ACI patients serum mir-210 expression differences were no statistically significant (P>0.05)； ≤60 years old and >60 years old ACI patients serum mir-210 expression differences were no statistically significant (P>0.05)； Severe ACI patients serum mir-210 expression (1.10±0.08) 2-△△Ct，was significantly lower than that in the mild and moderate patients，the difference was statistically significant (P<0.05). Moderate ACI patients serum mir-210 expression (1.29±0.10) 2-△△Ct，which was lower than the mild patients，the difference was statistically significant (P<0.05)； mir-210 on ACI the area under ROC curve was 0.961，95%CIwas 0.926～0.996，cut-off value was (1.378) 2-△△Ct，sensitivity was 91.30%，specificity was 97.54%. Conclusion The serum miR-210 expression in acute cerebral infarction patients decreases and is related to the severity of acute cerebral infarction，which can be used as the basis for the diagnosis of acute cerebral infarction.

【Key words】Acute cerebral infarction； miR-210； Diagnostic value； Disease level

【中图分类号】R743.33

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)03-0003-03