病毒性脑炎患者脑脊液博尔纳病病毒p40基因片段的检测

陈　静　徐　平　刘海军

遵义医学院附属医院神经内科　遵义　563003



·论著·

病毒性脑炎患者脑脊液博尔纳病病毒p40基因片段的检测

陈静徐平△刘海军

遵义医学院附属医院神经内科遵义563003

【摘要】目的探讨贵州遵义地区病毒性脑炎中博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)的感染情况以及BDV与病毒性脑炎的关系。方法采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ RT-PCR)方法检测了54例病毒性脑炎患者和45例外科手术患者(除外神经系统疾病及其他常见病毒感染性疾病)脑脊液(CSF)中BDV p40基因片段，对阳性产物进行基因序列测定及分析。结果病毒性脑炎患者CSF中BDV p40基因片段阳性率为11.1%(6/54)，明显高于对照组(0)，Fisher精确概率检验，P<0.05；其中2例外周血单核细胞(PBMC)及CSF BDV p40基因片段均为阳性。PCR扩增的目的基因片段阳性产物测序后，与NCBI网站GenBank提供的BDV标准病毒株V核苷酸序列比较同源性为100%，未发生突变。结论遵义及周边地区部分病毒性脑炎患者中存在BDV感染；感染人体的BDV p40 中段基因片段存在高度的保守性，变异小，BDV p40中段基因片段可能是证实BDV感染的敏感标记物。

【关键词】Borna病病毒； 核蛋白；逆转录聚合酶链反应

博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是有包膜的非节段性单股负链RNA病毒，具有高度的嗜神经性[1]。BDV感染的是宿主十分广泛，包括马、羊、兔、猫、狗、牛、猴子、骆驼、羊驼、河马以及包括人类在内的灵长类。确定能被BDV感染并引起典型的博尔纳病(Borna disease，BD)的是马、羊。大量研究表明，BDV感染同神经系统疾病有关，但能否引起人类BD仍有争议[2]。无论是BDV核蛋白(nucleoprotein，p40)基因还是核蛋白在宿主细胞内的含量都是最高的，同时BDV p40基因片段也具有保守性以及变异性小的特点，这也让BDV p40成为BDV检测的理想指标之一。本实验采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ RT-PCR)检测病毒性脑炎患者脑脊液中的BDV p40基因片段。

1材料与方法

1.1研究对象病例组系遵义医学院附属医院神经内科2013-10—2014-03住院收治的54例神经系统疾病患者，男26例，女28例，平均年龄(38.4±10.7)，全部来自遵义市及周边地区，包括遵义县14例，仁怀市9例，湄潭县9例，桐梓县8例，务川县7例，道真县4例，正安县3例，收集脑脊液5 mL，脑脊液标本采自患者发病后5 d内。参照人民卫生教育出版社出版的第2版供8年制及7年制《神经病学》诊断标准，患者临床表现、血常规检测、脑脊液常规生化检测、脑电图及影像学等检查均至少有2项符合VE的诊断标准。对照组系本院非神经系统疾病外科手术患者45例脑脊液，男17例，女28例，平均年龄(33±6)岁，均来自遵义市及周边地区。其中遵义市11例，遵义县9例，桐梓县7例，赤水市5例，湄潭县8例，凤岗县5例。所有研究对象均除外常见嗜神经病毒感染，包括麻疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒。

1.2主要试剂及仪器BDV p40基因片段引物及探针设计参考文献[3]，p40-forward primer 5’-GGTTTAAAACTATGATGGCAGCCTTA-3’，p40-reverse primer 5’-GTGGATTAAACATCTGGAGTAGTGTAGC-3’，p40-probe 5’-FAM-ACCGGCCATCCCATGGTGAGAC-TAMRA-3’，扩增产物为78 bp。引物及探针均由美国Invitrogen公司合成。PrimeScripTMRT reagent kit、RT-PCR预混液购自大连TaKaRa公司，Viral RNA/DNA Mini Kit购自美国Invitrogen公司，BDV重组质粒由广州蓝吉生物技术有限公司合成。PCR仪和荧光定量PCR仪分别是BIO-RAD公司的C1000TM thermal cycler和 C1000TM Touch thermal cycler。所有吸头、试管、EP管均选用Axygen公司生产的去酶硅化耗材。

1.3方法

1.3.1总RNA提取：分别收集明确诊断为病毒性脑炎患者发病5 d内脑脊液及对照组脑脊液各5 mL，用Viral RNA/DNA Mini Kit提取CSF细胞总RNA，分光光度计测浓度及OD值(1.8～2.0)及浓度，置于-80 ℃保存备用。

1.3.2BDV质粒标准曲线制作：将BDV重组质粒定量并计算其拷贝数，梯度稀释成108、107、106、105、104、103、102拷贝/μL作为阳性模板在C1000TM Touch thermal cycler在进行PCR扩增，CFX96TM Real-time system分析结果并得出PCR扩增的动力学曲线。

1.3.3FQ RT-PCR检测BDV p40基因：逆转录反应体系如下：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，Oligo dT Prime 1 μL，Random 6 mers 4 μL，Total RNA 6 μL，RNase dH2O 4 μL，总体积20 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。RT-PCR反应体系：Premix Ex Taq 12.5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，Taqman Probe 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL，总体积25 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，59 ℃退火延伸30 s。每次实验均设阳性、阴性及空白对照，每次实验每例标本做2个复孔，并重复3遍。

1.3.4阳性产物的鉴定和序列分析：将BDV p40基因片段阳性产物PCR扩增产物5 μL加样，以3%琼脂糖3～4 V/cm电压电泳45 min，在凝胶成像系统扫描并照相。将BDV p40基因片段阳性标本送至大连宝生物技术有限公司基因测序。

1.4统计学方法采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，计数资料采取Fisher精确概率检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

病例组54例中6例CSF BDV p40基因片段阳性，阳性率11.1%，其中2例PBMC及CSF中BDV p40基因片段均为阳性，对照组均为阴性，阳性率为0。

2.1浓度分别为108、107、106、105、104、103、102拷贝/μL的BDV重组质粒PCR扩增曲线图见图1。以起始拷贝数的自然对数为横坐标，CT值为纵坐标得到扩增效率为99.6%，相关系数为0.992，截距为42.251，斜率为-3.332的定量标准曲线，说明起始模板浓度与CT值间保持良好的线性关系，可用于未知样本中目的基因拷贝数的计算。

图1　梯度稀释的BDV重组质粒PCR扩增曲线

2.2阳性患者CSF中BDV基因的表达水平及扩增图见图2。

图2　6例患者BDV p40基因阳性CSF PCR扩增曲线

2.3BDVp40基因阳性标本CSF中BDV p40的拷贝数见表1。

表1　BDV p40基因阳性标本CSF中BDV p40的拷贝数

2.4BDV p40基因阳性CSF PCR扩增BDV p40基因片段电泳图见图3。

图3不明原因的病毒性脑炎患者脑脊液PCR扩增BDV p40基因片段电泳图M为DNAmarker，1-6为阳性脑脊液PCR扩增产物，产物长度为78 bp，7为阴性脑脊液PCR扩增产物

2.5测序结果PCR扩增的目的基因片段阳性产物测序后，与NCIB网站GenBank提供的BDV标准病毒株V核苷酸序列比较同源性为100%，未发生突变。PCR扩增后目的基因片段序列测定结果与BDV标准病毒株V核苷酸序列比较：Strain V(核苷酸序号：U04608.1)

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VE

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3讨论

近年来，在人类基因组发现内源性似BDV核蛋白基因序列(endogenous Bornalike N sequences，EBLNs)使得大家对BDV的研究更加有兴趣[4]。BDV宿主较为广泛，越来越多的物种被检测出BDV感染的证据，但目前确定能被BDV感染且能致病的是马和羊，人类是其宿主之一，是否能致病仍有争议，世界各地都有检出，我国在重庆、新疆、宁夏、贵州及哈尔滨都有检出[5]，因此，对BDV流行病学方面的研究很有必要。

目前对BDV检测的标记物主要有BDV p40和p24的RNA、抗原、特异性抗体及免疫复合物(CIC)，由于血液较脑脊液的收集更为方便，同时脑脊液中的有形成分含量少的特点，因此多数研究都以血液为主，而对脑脊液的研究较少，国内仅王振海等[6]、郭振元等[7]对脑脊液中BDV p24的进行检测，尚未见对脑脊液中BDV p40进行研究，本实验以脑脊液BDV p40为研究对象。BDV检测主要方法包括PCR、ELSIA、WB及病毒分离，各有其优缺点，至今仍无统一标准，本实验采用FQ RT-PCR(探针法)对BDV p40基因片段进行检测，特异性和灵敏性都较好，与常用的nRT-PCR相比能够降低交叉污染的可能性和假阳性的概率，而探针法的特异性也较普通荧光染料法好，且操作简单。

本次研究采用FQ RT-PCR(探针法)对遵义及周边地区54例病毒性脑炎患者脑脊液和45例对照组患者脑脊液进行BDV p40基因检测，病例组阳性率为11.1%(6/54)，拷贝数如表1所示；对照组阳性率为0；Fisher精确法对其进行统计分析，P=0.03。说明遵义及周边地区存在BDV感染，病毒性脑炎可能与BDV的感染有关。6例脑脊液BDV p40阳性患者中2例血液中的BDV p40 阳性，而4例脑脊液BDV p40阳性患者血液中的BDV p40阴性，提示脑脊液和血液中的BDV p40片段的检测结果并不完全对等。分析其产生的原因可能有：(1)由博尔纳病病毒的特性决定，博尔纳病病毒是高度的嗜神经病毒，主要寄生于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞内，尽管外周血淋巴细胞、尿液、泪液中也存在，但含量仍较神经细胞中少[8]。(2)可能与博尔纳病病毒的传染病学特点有关，博尔纳病病毒主要通过嗅神经和三叉神经直接侵犯并进入神经系统内[9]，避开血脑屏障的屏蔽作用，而不是通过神经系统以外的途径感染宿主。(3)宿主因素：由于血脑屏障的作用使得脑脊液和血液中的BDV分布不同。

早在1998年谢鹏等[10]对5例BDV p24基因片段阳性精神分裂症患者、4例BDV p24基因片段阳性情感障碍患者及3例健康献血者的血液进行BDV p40基因前部片段的检测结果发现，结果均是阴性，提示感染人和感染动物的BDV p40前部基因片段同源性较小。但徐平等[11]在2004年采用nest RT-PCR对BDV p24阳性的1例病毒性脑炎、2例精神分裂症和1例情感障碍病人进行BDV p40中部基因片段进行检测发现其中4例BDV p40中部基因片段阳性，提示BDV p40中段基因片段可能是BDV感染的另一可靠指标。本实验PCR扩增的目的基因片段阳性产物测序，与NCBI网站GenBank提供的BDV标准病毒株V核苷酸序列比较同源性为100%，未发生突变，说明感染动物和感染人的BDV p40中部基因差异性小，同源性好；进一步证明BDV p40中部基因片段可作为BDV感染的可靠指标。

4参考文献

[1]Lipkin WI，Briese T，Hornig M. Borna disease viruse-fact and fantsy[J]. Virus Res，2011，162(1、2)：162-172.

[2]Kinnunen PM，Palva A，Vaheri A，et al. Epidemiology and host spectrum of Borna disease virus infections[J]. J Gen Virol，2013，94(Pt 2)：247-262.

[3]Schindler AR，Vögtlin A，Hilbe M，et al. Reverse transcription real-time PCR assays for detection and quantification of Borna disease virus in diseased hosts[J]. Mol Cell Probes，2007，21(1)：47-55.

[4]Feschotte C. Virology： Bornavirus enter the genome [J]. Nature，2010，463(7 277)： 39-40.

[5]Zhang L，Xu MM，Zeng L，et al. Evidence for Borna disease virus infection in neuropsychiatric patients in three western China provinces[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2014，33(4)：621-627.

[6]王振海，谢鹏，杨平，等. 病毒性脑炎患者血液和脑脊液博尔纳病病毒P24的检测[J]. 中华神经科杂志，2006，39(2)：105-108.

[7]郭振远，徐平，姚能云. 病毒性脑炎患者血液和脑脊液博尔纳病病毒P24核苷酸片段的检测[J]. 中国人兽共患病学报，2008，24(3)：193-197.

[8]吴伟，谢鹏，邹德智，等. 博尔纳病病毒PRF1基因中部片段的检测[J]. 中华微生物和免疫学杂志，2004，24(1)：61-63.

[9]Susan L，Pauline D，Jianhua G，et al. Birds and Borna viruses[J]. Anim Health Resrev，2012，13(2)：145-156.

[10]谢鹏，岩田太秀，高桥和郎，等. 感染人体的博尔纳病病毒ORF1基因前部片段的检测[J].中华微生物和免疫学杂志，1998，18(3)：172-175.

[11]徐平，谢鹏. 博尔纳病病毒的免疫发病机制[J]. 免疫学杂志，2003，19(3)：87-90.

(收稿2014-12-22)

Detection of the p40 nucleotide fragment of Borna disease virus from cerebrospinal fluid of patients with viral encephalitis

ChenJing，XuPing，LiuHaijun

DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003，China

【Abstract】ObjectiveTo discuss the relationship between Borna disease virus(BDV) and the viral encephalitis and study the infection situation of Brona disease virus(BDV) in patients with viral encephalitis in Zunyi of Guizhou province. Methods The p40 nucleotide middle fragment of BDV in cerebrospinal fluid(CSF) in 54 patients with viral encephalitis and 43 control patients without neverous system disease and were not infected with usual virus but with surgical operations were examined by the reverse transcriptase PCR and fluorescence quantitative PCR(FQ-RT-PCR). Results It was found that the positive was 6/54(11.1%) and it was significantly higher than that of the controls 0/45，in which the Fisher test：P=0.03. 2 of 6 were also positive in peripheral blood mononuclear cell (PBMC). The homologies of gene sequence of aim gene fragment amplified by PCR with the standard virus strains V supplied by NCBI web station of GenBank were 100%，there were no mutations. Conclusion These results suggest that BDV infection really exists in patients with viral encephalitis in Zunyi and the surrounding regions of Zunyi and the infection of BDV may be related to viral encephalitis. The p40 nucleotide middle fragment of BDV is very conservative and rare mutational and it may be a sensitive marker

【Key words】Viral encephalitis； Borna disease virus； Reverse transcriptase polymerase chain reaction

【中图分类号】R512.3

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)03-0001-03

通讯作者：△徐平，博士，E-mail：xuping527@sohu.com

基金项目：国家自然科学基金(31160210)