骨髓细胞学结合流式散点图双向验证进行微小残留分析

2016-02-27蔡艳霞张素贞房胜春李玉芬河北北方学院附属第一医院检验科河北张家口075000河北北方学院附属第一医院儿内科河北张家口075000河北北方学院附属第一医院门诊部河北张家口075000

河北医科大学学报 2016年2期

张　斌，蔡艳霞，张素贞，房胜春，李玉芬(.河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000；.河北北方学院附属第一医院儿内科，河北张家口 075000；3.河北北方学院附属第一医院门诊部，河北张家口 075000)

·论著·

张斌1，蔡艳霞2，张素贞1，房胜春1，李玉芬3*(1.河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院儿内科，河北张家口 075000；3.河北北方学院附属第一医院门诊部，河北张家口 075000)

[摘要]目的采用流式细胞技术结合骨髓细胞形态学双参数双向验证分析微小残留病细胞。方法对微小残留病检测患者进行形态学与流式散点图双向验证，分析微小残留病细胞的特点。结果采用该方法分析的样本阳性检出率高且不易漏诊。结论采用骨髓细胞学结合流式散点图双向验证进行微小残留分析，阳性检出率高且漏诊率低。

[关键词]骨髓细胞；流式细胞术；治疗结果

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.028

微小残留病是指白血病经诱导化疗获完全缓解后或骨髓移植后，体内残留有少量白血病细胞的状态。当今对微小残留病主要有基因检测、流式细胞技术检测等方法，各实验室还没有完全统一的分析方法及标准化操作，本实验室近年来采取流式细胞技术及细胞形态学2项检测相互验证的方法，对微小残留病进行分析，疗效判断标准按照张之南、沈悌主编的《血液病诊断及疗效标准》第3版[1]。现将本实验室近年来对32例微小残留病分析结果报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择我院2011—2013年急性淋巴细胞性白血病14例和急性非淋巴细胞白血病18例进行微小残留病分析检测的患者。分析评估获检测阴性者25例(M3 10例，M2 5例，M5 3例，B-ALL 7例)，阳性者7例(M3 3例，M5 1例，M2 1例，B-ALL 2例)。其中1例本实验室分析阳性而北京某检验所单一流式分析阴性患者45 d后骨髓形态学检测原始细胞7.5%为阳性骨髓复发，其余检测阴性者停药至今(>1年)未见1例复发。

1.2实验室检查

1.2.1流式细胞检测对标本进行50~100万个细胞以上多抗体组合检测，其中髓系白血病主要包括CD3、CD5、CD7、CD19、CD14、CD64、CD34、CD38、CD13、CD33、CD16、CD11b、HLA-DR、CD15、CD117、MPO等，B淋系白血病主要包括CD3、CD5、,CD7、CD19、CD20、CD22、CD9、CD23、CD34、CD38、CD13、HLA-DR、MPO、CD79a等[2]。通过以上检测观察有无幼稚细胞跨系列表达、跨阶段多表达和缺失表达，以及幼稚细胞发育停滞等现象[3]。

1.2.2细胞形态学观察比对主要采取低倍镜全片或大面积寻找幼稚细胞后转高倍镜进行幼稚细胞形态学评估。评估要点有：整体形态(有无多边形、梭形、手镜形等)、核浆比例失衡、核出芽、核肿胀等病态造血现象[4]。

2结果

对32例患者采用以上方法分析，所有检测阴性者在低倍镜下，多视野(至少50个有幼稚细胞视野)观察未发现原始细胞形态不规则、大小不一、核浆比例不平衡，以及染色质肿胀、出芽现象，符合流式细胞散点图原始细胞无任何跨系列、跨阶段表达，CD34、CD38走向正常，无幼稚细胞停滞现象。如果有一项指标符合以上描述均视为微小残留病分析检测阳性。部分细胞形态学及流式散点图结果，见图1~6。

图1所示细胞为检测阳性细胞(原发M5)，此类细胞胞体中等形态似梭形，染色质疏松，染色质偏于一侧，且有扭曲折叠，核仁明显(瑞氏染色 ×1 000)

图2所示细胞为检测阳性细胞，此类细胞胞体较大，不规则，染色质疏松肿胀，核仁明显，胞浆中可见分布不均匀、大小不等颗粒，且易见伪足(瑞氏染色 ×1 000)

图3所示细胞为检测阴性细胞，此类细胞胞体中等大小，形态规则，染色质疏松，核仁1~2个，无扭曲折叠、核出芽等现象(瑞氏染色 ×1 000)

图4对应图1 流式细胞，该病例原始细胞占1.65%，流式结果主要表达B淋巴细胞免疫标志CD19、CD10、HLA-DR，但其有异常系外表达CD64以及CD34 表达停滞现象，未有向CD38过度表达的痕迹

图5对应图2，该细胞群CD34向CD38过度发育散点图有明显断裂走势，另外幼稚细胞群既有髓系CD33表达又有淋系CD19的异常表达

图6对应图3，该细胞群表达幼稚淋巴细胞，未见异常表达

3讨论

在评价微小残留时，在形态学方面主要考虑原始细胞所占有核细胞比例，>5%为骨髓未见缓解，<5%为骨髓完全缓解。对于原始细胞的良恶描述很少或近乎没有形态学工作者对其进行判断，可能是由于形态学工作者专一从事其工作，未对流式细胞术或更多检查手段进行对比研究，没有人描述什么样的原始细胞更趋向于正常细胞，什么样的细胞可能趋向于恶性细胞。

3.1原始细胞形态在形态学诊断工作中，特别是原始细胞比例偏低时，绝对不应以原始细胞的比例进行骨髓报告的判断，而应该以形态学特点加以分析，主要包括：①原始细胞的整体特点，有无形态各异的原始细胞，如多边形、梭形、手镜形及不规则形等；②细胞核的观察，如有无核肿胀出芽、胞核偏于一侧，同一标本中观察多个原始细胞有无胞核形态各异(既有规整者又有其他者)；③细胞质的观察，有无多边形伪足、内外浆等现象。对于以上细胞的观察诊断应主要分析其一致性，如果同一标本容易发现不一致细胞特点，应考虑非正常原始细胞存在，进而结合流式细胞分析结果及散点图走向特点。

3.2流式细胞技术分析白血病相关的免疫表型主要包括以下4种类型：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及表达缺失[5]。许多研究表明，不能因为骨髓中不成熟细胞的量而判断为微小残留病阳性。正常的骨髓细胞没有免疫标志异常高表达和异常低表达，只有异常免疫标志表达足够显著时才可被用于判断微小残留的细胞[6]。采用流式细胞技术分析微小残留病，主要观察原始细胞的发育走向，如在进行最少100万个细胞分析的基础上单独设门进行原始细胞的分析，如发现有原始细胞CD34到CD38发育停滞或有断裂现象及原始细胞跨阶段表达(髓系CD16/11b，淋系CD20/22尤为重要)，要结合有无形态异常进而判断其原始细胞的质量。在检测跨系列表达时，并非要按照首发时原始细胞的表达进行分析，应该增加它系典型抗体。本研究中多次化疗后检测到的病理细胞表达情况并非与首发时表达完全一样，如M3的患者检测到在幼稚B淋巴细胞的表面表达CD64，同时形态学原始细胞形态各异，有核出芽等现象。Kern等[7]总结了文献报道的1 400例新诊断和未治疗AML患者的白血病相关免疫表型分布情况，结果显示抗原跨系列表达者占23．5%，跨阶段表达者占20.6%，过度表达者占36.1%，表达缺失者占19.8%，其中绝大多数检测出的LAIP仅见于5%以下的患者。因此，建议采用较大的抗体组合及三色以上的MPFC分析进行LAIP的检测。我们主张在进行髓系检测的时候至少增加淋系CD19、CD7、CD79a；在进行淋系检测的时候至少增加淋系CD13、CD33、CD64、MPO的检测。

综上所述，在分析微小残留病样本时至少结合形态学及流式细胞2项技术进行，2项技术相互印证地分析同一标本得出的结果更符合实际病情。但本研究样本量较少，需增加样本量进一步探讨。

[参考文献]

[1]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学出版社，2007：106-115.

[2]王建中. 临床流式细胞分析[M].上海：上海科学技术出版社,2006：344-345.

[3]王红霞，朱芸，王翠霞，等. 急性髓系白血病形态学诊断与免疫学分型[J]. 河北医科大学学报，2007,28(4)：291-294.

[4]邱卫华，郭庆云，张英芬. 骨髓增生异常综合征中病态造血的特点与鉴别诊断[J].河北医科大学学报，2008,29(4)：584-586.

[5]Campana D，Coustan-Smith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytomemy[J].Cytomemy,1999，38(4)：139-152 .

[6]王璐璐，王建中，屈晨雪，等. 八色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微小残留病方法的建立[J].中华检验医学杂志，2012，35(5)：423-430.

[7]Kern W，Schoch C，Haferlach T，et al. Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2005,56(2):283-309.

(本文编辑：刘斯静)·研究快报·

[中图分类号]R551.3

[文献标志码]B