肺炎链球菌实验室诊断方法的研究进展



肺炎链球菌实验室诊断方法的研究进展

刘美蓉1(综述)，谭效锋1，陈哲2*(审校)(1.天津医院普内科，天津 300211；2.天津医科大学总医院保健医疗部，天津 300052)

[关键词]肺炎球菌感染；诊断技术和方法；综述文献

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.034

在世界范围内，下呼吸道感染是感染性疾病的主要死亡原因[1]，但约40%社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)仍然病原不明确，致病原可能为肺炎链球菌[2-3]，分析其原因为：①肺炎链球菌是一种苛养菌，可以产生自溶酶，送检时间要求严格，实验室中普通培养基或涂片革兰染色检查可与草绿色链球菌混淆，培养和菌种菌型鉴别过程复杂，导致诊断率降低；②社区感染患者住院率低，因培养检查时间长，门诊留取标本培养比例也低[4]，同时早期抗生素的应用降低了血及胸腔积液培养的阳性率；③由于侵入性诊断技术的应用局限，人为因素导致痰标本的合格率低。所以，临床诊断肺炎链球菌性肺炎目前存在一定困难，易导致误诊延误治疗，尤其在患者出现耐药肺炎链球菌感染时。因此，一些新的实验室诊断方法应运而生，如免疫层析法(immunochromatographic test，ICT)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、乳胶颗粒凝集试验(latex particle agg lutination test，LPAT)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等。近年研究显示ICT尿肺炎链球菌抗原检测可以明显提高临床诊断率[5-9]。现就肺炎链球菌的病原学特点及实验室诊断方法综述如下。

1肺炎链球菌的病原学特点

1.1形态特征肺炎链球菌简称肺炎球菌，旧称肺炎双球菌，是痰液中分离出的，革兰染色阳性，电镜下可见菌体似矛头状，涂片检查成双或成短链状排列的双球菌。

1.2致病机制除了细菌荚膜是肺炎链球菌的主要毒力因子，溶血素和神经氨酸酶也是致病物质。肺炎链球菌可以通过表面蛋白和人类鼻咽部上皮细胞表面受体相互作用而使细菌黏附于细胞。在呼吸道上皮层无损伤时，细菌可定植于呼吸道黏膜，与人处于共生状态，无致病性[10-11]。近年研究显示，不同人群上呼吸道携带此菌的比例有差别，如儿童高于成人[12]，低收入国家人群高于发达国家人群等[13]。当上呼吸道黏膜防御功能及正常肺部清除机制受损时易引发疾病，如炎性反应后上呼吸道黏膜损伤、慢性肺部结构病变等。该菌主要引起人类的肺炎，以大叶性实变为主要表现，也可以表现为小叶性肺炎，其次是支气管炎。肺炎链球菌引起肺炎后可继发中耳炎、乳突炎、肺脓肿、脑膜炎和败血症等。

1.3耐药性肺炎链球菌对青霉素的耐药机制是由青霉素结合蛋白(penicillin binding protein,PBP)-1a、PBP-2a、PBP-2b、PBP-2x质量和数量突变所引起的。对青霉素耐药的菌株对其他β-内酰胺类抗生素的敏感性也会降低。对β-内酰胺类抗生素耐药的肺炎链球菌常表现出多重耐药，如四环素类、大环内酯类、氯霉素类和磺胺异噁唑等药物，目前肺炎链球菌对氟喹诺酮类仍保持敏感，耐药菌株相对较少。肺炎链球菌对大环内酯类的耐药主要通过2种机制：①由erm介导的核糖体甲基化和由mef介导的外排泵系统；②有少数菌株由于核糖体突变导致耐药[10]。不但青霉素耐药的肺炎链球菌发生率在我国不同地区有较大差异，对青霉素不敏感菌株(penicillin is not sensitive strains of streptococcus pneumoniae，PNSSP)的比例也有差异。儿童感染PNSSP的机会要大于成人。有研究显示急性呼吸道感染患儿细菌性因素中肺炎链球菌占有比例最高约12.0%，并且200株肺炎链球菌中,耐青霉素的肺炎链球菌有182株(91.0%)[14]。肺炎链球菌对大环内酯类药物的耐药率甚至可达到96%[4]。刘又宁等[15]研究显示，我国导致CAP的肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药率达75.0%以上,对青霉素的不敏感率为20.3%。国内相近文献也报道452例CAP患者中明确病原体感染者187例，其中41株肺炎链球菌有产超广谱β-内酰酶18株(43.9%)[16]。不仅肺炎链球菌在下呼吸道感染中耐药性较高，在皮肤感染中也具有很高的耐药性，国内文献报道大面积烧伤患者皮肤感染来源的肺炎链球菌氨曲南、阿米卡星、美洛培南的耐药性较高，分别为85.4%、90.6%和76.9%[17]。

1.4致病性感染耐药肺炎链球菌后会加重患者的病情程度，增加预后不良风险。耐药肺炎链球菌感染的危险因素包括：①年龄>65岁或<2岁；②3个月内曾用β-内酰胺类抗生素；③酗酒；④内科慢性疾病(包括慢性心、肺、肝、肾疾病，糖尿病，恶性肿瘤，脾脏缺如，免疫抑制性疾病)；⑤免疫抑制状态(疾病所致或使用免疫抑制剂治疗的)；⑥接触过托幼所的儿童。所以据统计是否存在败血症、年龄和潜在性基础疾病等因素肺炎球菌性肺炎的病死率有时甚至可高达30%[2-18]。另外，引起重症肺炎最多的病原体也是肺炎链球菌，其特定的基因型感染人后可产生大量内毒素而引起严重的全身系统性炎症反应综合征，因此导致重症肺炎患者的病死率增高[19]。

2肺炎链球菌的传统实验室诊断方法

2.1肺炎链球菌的培养可作为培养的标本包括痰液、脓液、血液、脑脊液、肺泡灌洗液等标本，其中合格痰的标准是革兰染色显微镜下鳞状上皮细胞<10个/低倍镜视野、多核白细胞>25个/低倍镜视野，或二者比例<1∶2.5。合格的痰标本再进一步培养鉴定。典型的肺炎链球菌镜检革兰染色涂片为阳性球菌，菌体呈矛头状成双排列，坦面相邻，尖端向外，有时可以诊断；肺炎链球菌正常生长营养要求较高，为苛养菌，在普通培养基上生长不良，容易误认为草绿色链球菌，在含血液或血清的培养基上才能生长，所以分离培养常采用羊血平板，并且有助于其溶血特征的识别和进一步鉴定。在血平板上，肺炎链球菌的菌落呈灰白色、半透明状，直径0.5～1.5 mm，菌落表面光滑扁平状，也有菌株可表现为黏液状，菌落周围可见环绕着草绿色溶血环。因该菌可产生自溶酶，培养或放置24 h以上的培养物还会由于肺炎链球菌的自溶作用而使菌落中央塌陷边缘隆起，呈脐窝状，是一种典型的形态表现。肺炎链球菌还有一个特点就是经人工培养后荚膜逐步消失[20]。

2.2肺炎链球菌菌种的鉴定实验该菌落在普通琼脂培养基上呈绿色，易与草绿色链球菌混淆，所以实验室常采用以下常规鉴定方法。①胆汁溶菌试验：该试验的原理是基于胆盐能够通过活化肺炎链球菌的自溶酶而溶解肺炎链球菌，但它不能溶解草绿色链球菌。常用的方法包括试管法、平板法和玻片法等。其中试管法更为常用，具体操作是取2滴10%去氧胆酸钠溶液加入在1 mL待鉴定菌的18～24 h培养液中，于35 ℃下孵育5~10 min后进行鉴定，菌管内液体由混浊变为透明者为阳性，若仍浑浊为阴性；平板法是取一个接种环，取2%去氧胆酸钠溶液加于血平板待鉴定菌的菌落上，于35 ℃下孵育15～30 min，菌落溶解消失者为阳性，未消失或未完全消失者为阴性；最后玻片法是分别取1滴血培养液加至2张玻片上，在其中1张玻片上加入1滴10%去氧胆酸钠，在另一张玻片上加入1滴生理盐水，予以自然干燥处理，干燥后进行革兰染色，再油镜下观察，如发现球菌完全被溶解，而对照玻片上显示细菌完全未溶解或部分溶解为阳性结果[18]。②奥普托欣试验：也是与其他草绿色链球菌相鉴别的手段。具体方法是用接种环将单个待鉴定菌落均匀涂于血平板上，用含量为5 μg的奥普托欣纸片贴于接种区中央，在35 ℃下行需氧培养，并过一夜后观察，如果抑菌圈>18 mm为阳性。

2.3肺炎链球菌菌型鉴定一些特殊血清型的肺炎链球菌(如血清型3和37)生长形态不典型，需要做进一步菌型鉴别，常用的方法有：①荚膜肿胀试验也称为Quellung试验，用新鲜的标本悬液与等量不稀释的肺炎球菌分型诊断血清混合后，覆以盖玻片，在油镜下观察，标本中肺炎球菌若与同型免疫血清相遇，其荚膜将显著增大。②凝集试验，将可疑肺炎球菌与已知标准分型的血清作玻片凝集试验，若细菌凝集成堆，则为同型肺炎球菌。

3肺炎链球菌的实验室新近诊断方法

以上传统培养方法要求实验室具备一定的条件，对实验人员的技术要求高，但因试验步骤繁多，不确定因素较多，故而试验敏感性差，并且获得检验结果需要时间长，为临床肺炎链球菌感染的诊断带来困难，所以近年来一些快速简便敏感性较高的检测方法逐渐显现优势。

3.1ICTICT是一种检测肺炎链球菌可溶性抗原的快速方法,目前在我国尚未广泛应用于临床。其检测抗原为C-polysaccharide(PnC)抗原,位于细菌细胞壁的C多糖中,为肺炎球菌各血清型所共有。由于ICT以尿样作为检测对象,所以又称尿抗原检测法。美国Binax,Inc公司生产Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test试剂盒目前在国外应用较为广泛，并有较多文献研究其敏感性、特异性。Binax NOW试剂的临床敏感性和特异性，在美国多家机构及中心进行了较大样本的研究。其中包括回顾性研究和前瞻性研究，回顾性研究用标准方法推算Binax NOW试验性能，敏感性是86%、特异性为94%、总准确度是93%，95%可信区间分别是71%~94%、91%~96%、90%~95%。前瞻性研究用Binax NOW试验对住院患者和门诊患者进行了同等测试，门诊性能：敏感性90%、特异性78%、准确度80%，95%可信区间分别是70%~97%、70%~85%、72%~86%。住院性能：敏感性90%、特异性71%、准确度73%，95%可信区间分别是60%~98%、59%~80%、62%~82%。该试剂敏感性能数据指标还作出血清型评估：代表23个肺炎链球菌血清型的44株分离菌株引起了美国乃至全世界90%以上肺炎球菌感染。它们都在培养基上生长且在105细胞/mL时Binax NOW试验阳性。尿液检测限把1∶250稀释度作为Binax NOW试验的检测限。该试剂交叉反应性指标尿液检测回顾性研究中从338位阴性患者中分离出270种微生物，当用纯培养进行测试时，这些微生物在Binax NOW试验中均未产生交叉反应性。全微生物检测为了确定Binax NOW试验的分析特异性，收集了144份交叉反应物，包括与肺炎有关的微生物和可能作为正常菌群在泌尿生殖道发现的微生物，以及引起尿道感染的微生物。所有微生物都在106~109CFU/mL用Binax NOW试验进行了评估，在144例微生物中有143例无交叉反应性，唯一阳性的微生物是缓和链球菌，由于它和Binax NOW试验有共同抗原，交叉反应是可预期的。干扰物质检测用Binax NOW肺炎链球菌试验对白细胞数(每低倍镜视野的数量)、红细胞数(每低倍镜视野的数量)、蛋白(5 g/L)、糖(>20 g/L)、混浊度升高的尿液标本进行了评估，发现对试验性能没有造成影响。重复性研究分别在3家床边护理机构用一组含阴性、弱阳性、阳性、强阳性的单盲编码标本对Binax NOW肺炎链球菌抗原检测试剂盒(胶体金法)进行单盲研究。含有硼酸和不含硼酸的样本都进行了测试。参与者在3 d内对每一标本进行多次测试。359份测试标本中有357份(99.4%)产生了预期结果。此试剂盒在成人诊断中有较好的敏感性和特异性,而在儿童中特异性差异较大，可以作为诊断成人肺炎球菌性CAP的有效方法之一。Monno等[21]选取2007年1月—2012年2月1 414例CAP患者做的回顾性研究显示，该方法敏感性高于痰培养、血培养。Genné等[5]选取67例CAP成年患者与81例健康者作对照后获得尿肺炎链球菌抗原检测试剂的敏感性为64.3%，特异性为98.8%。

但Binax NOW检验方法有一定的局限性：①Binax NOW肺炎链球菌抗原检测试剂盒(胶体金法)仅用尿液和脑脊液标本验证过，其他可能含有肺炎链球菌抗原的标本(如血浆或其他体液)尚未进行过评价。②Binax NOW试验阴性不能排除肺炎链球菌感染，因此应与培养结果、血清学或其他抗原检测方法学结合作出准确诊断。③未对服用抗生素超过24 h的患者或新近完成抗菌治疗的患者用Binax NOW肺炎链球菌抗原检测试剂盒(胶体金法)进行过评价，也未对非处方药对肺炎球菌性脑膜炎患者的影响进行确定。④使用肺炎链球菌疫苗后48 h内可能对尿液中 Binax NOW肺炎链球菌抗原检测试剂盒(胶体金法)造成假阳性结果。疫苗对肺炎球菌脑膜炎患者的影响未做确定。因此，建议使用肺炎链球菌疫苗后5 d内不要进行Binax NOW肺炎链球菌检测。⑤Binax NOW试验对小儿尿液的准确性还未得到证实，另对小儿脑脊液的性能已得到了证实。

3.2ELISAELISA特异性好,敏感性高,是具有较好应用前景的方法之一。采用ELISA 检测尿样中完整形态的肺炎球菌溶血素分子，与ICT相比有相似的敏感性[22]，但操作方法与结果获得不如ICT方便快捷。

3.3LPATLPAT操作简便、结果快速,是较早用于检测肺炎球菌的血清学方法，但LPAT存在较多假阳性结果,结果分析带有主观性,其检测的PCA抗原为特异型抗原,检测不同血清型肺炎球菌需要不同抗体,而ICT检测的PnC 抗原为各血清型所共有。因此,与ICT 相比,LPAT 还存在局限性,不能用于肺炎球菌各血清型的检测[9]。

3.4PCRPCR敏感性高、特异性强,特别是实时定量PCR方法。实时定量PCR 可重复定量检测扩增产物,在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据,对扩增产物进行实时监控,从而增加了PCR特异性和敏感性。但是与ICT相比,PCR仍是一种相对复杂、费时的检测方法,全过程需10 h左右,还未完全标准化,因而尚未成为肺炎球菌的临床诊断方法,主要作为实验室研究的技术方法[9]。

此外，还有环介导恒温扩增技术快速检测痰标本肺炎链球菌的方法[23]，血液中肺炎链球菌的建立扩增片段长度多态性快速检测方法等[24]。近年来Sawa等[25]在动物实验中证实，抗体检测核糖体蛋白L7/L12有可能成为一种新的有发展前景的检测手段；Hotomi等[26]提出ODK-0901多克隆抗体检测肺炎链球菌引起的急性中耳炎和急性鼻窦炎比肺炎链球菌尿抗原检测更有价值，尤其对于儿童患者。

4结语

肺炎链球菌检测有诸多方法，但就其快速、简单的特性首选是ICT，在各国临床医生工作和研究中尿肺炎链球菌抗原检测已十分普及，该检测手段与传统实验比较有更高的敏感性和特异性[5]；同时为临床医师选择抗生素提供了良好地依据，减少了患者的诊治费用。目前由于抗生素的不规范使用，临床医生初次诊治CAP患者时其多已使用一种或多种抗生素，所以使用抗生素后对肺炎链球菌抗原检测敏感性的影响尚需进一步研究，以便为临床医生检测患者时提供可靠依据，提高肺炎链球菌性肺炎的诊断率。

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(本文编辑：赵丽洁)

·综述·

[中图分类号]R515.9

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)02-235-05

通讯作者*。E-mail:tjzyycz@sina.com

[作者简介]刘美蓉(1978-)，女，河北景县人，天津医院主治医师，医学硕士，从事普内科疾病诊治研究。

[收稿日期]2014-06-04；[修回日期]2014-06-24